做實驗前要先學會凍存，以備自己在后面的實驗中能保持同一來源、穩定可靠的細胞，且可減少污染或其它不利影響。

1、影響凍存細胞活性的因素

（1）細胞凍存保護劑：常用的有二甲基亞砜（DMSO）和甘油，常用的濃度為5%-10%（90%小牛血清）。DMSO對二倍體細胞的毒性較甘油小。

（2）細胞懸液的凍結速度：慢凍時冰凍在細胞外形成，因此不致損害細胞。多數細胞以每分鐘下降1℃的速度，降至-20℃凍結。均可獲得滿意效果。

（3）保存溫度：液氮罐，可達到-196℃，此時所有的物理化學活動均降至zui低限度，以保證細胞長期保存。

（4）復蘇：急速融化復蘇可防止損害細胞。凍結細胞從液氮中取出后，應立即放入37℃~43℃的水浴中，30秒至一分鐘內融化。

2、凍存與復蘇方法

適用于原始組織、原代細胞和細胞系（株）。

（1）細胞用胰蛋白酶+EDTA消化后用凍存液稀至2~5X106/ml。

（2）分裝于2ml凍存管中，裝量1ml，封口，作好標記，用幾層紗布扎好。

（3） 凍存管進入液氮前應有一個漸降溫的過程，以1℃/min的速度降溫，一般掛在液氮上空8小時后，投入液氮貯存罐中長期保存。

（4）為使凍存的細胞復蘇，將凍存管置于37℃~43℃水浴中，充分搖動使其急速融化，30秒至1分鐘內完成。

（5）細胞懸液低速離心，去除上清中的保護添加劑，加入原來使用的生長液，置37℃培養。

基本設備和試劑

設備（略），環境要求清潔、空氣干燥和無煙塵。

基本試劑

培養液：①1640溶于新蒸的三次蒸餾水中，攪拌使其充分溶解，過濾除菌即可。②小牛血清用前56℃X30分鐘滅活（破壞補體）分裝置-20℃保存備用。③青鏈雙抗液將100萬單位的青霉素鈉鹽和硫酸鏈霉素用高壓2次后的三蒸水100ml充分溶解，分裝凍存于-20℃，使用前融化，每100ml生長液中加1ml，即使用終濃度為含P.S 100μg/ml。（注：P.S不能凍融多次，應少量分裝，一次用完）。④NaHCO3液，用于調整pH值，常用濃度為5~6%，配制用三蒸水溶解后過濾除菌或高壓滅菌，分裝4℃保存。⑤胰蛋白酶在pH 8.0，溫度37℃時作用力zui強（詳見配方）。⑥EDTA液（詳見配方）。

附：

胰酶消化液配方（500ml）

NaCl 4g

KCl（19%）1 ml

Na2HPO4 0.126g（12H2O）

Tris1.5g（三羥甲基氨基甲烷）

以上藥物充分溶解后加水至500 ml，然后再加胰蛋白酶5g，zui后用1N HCL調pH至7.7，過濾除菌分裝，然后-20℃保存備用。

EDTA液配方（0.2% 1000ml）

EDTA（versene） 2 g

NaCl 8g

KCl 0.2g

Na2HPO4（12H2O） 2.9g

KH2PO 40.2g

以上藥物同樣充分溶解后，加新鮮的三蒸水至1000 ml，分裝然后高壓15磅30分鐘滅菌，zui后4℃保存備用。

細胞凍存液：小牛血清90℅與二甲基亞砜（DMSO）10℅混合；-20℃冰箱保存備用。或小牛血清30℅，1640培養液60℅，DMSO10℅混合； - 20℃冰箱保存備用。