人過敏毒素/補體片斷4(C4a)ELISA試劑盒

    本試劑僅供研究使用

 試驗原理：

    C4a試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知C4a濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將C4a物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中C4a的活性濃度呈比例關系。

  試劑盒內容及其配制

    試劑盒成份（2-8℃保存）96孔配置48孔配置配制

    96/48份酶標板1塊板（96T）半塊板（48T）即用型

    塑料膜板蓋1塊半塊即用型

    標準品：400ng/ml1瓶（0.6ml）1瓶（0.3ml）按說明書進行稀稀

    空白對照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）即用型

    標準品稀釋緩沖液1瓶（5ml）1瓶（2.5ml）即用型

    生物w素標記C4a抗體1瓶（6ml）1瓶（3.0ml）即用型

    親和鏈酶素-HRP1瓶（10ml）1瓶（5.0ml）即用型

    洗滌緩沖液1瓶（20ml）1瓶（10ml）按說明書進行稀釋

    底物A1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型

    底物B1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型

    終止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型

   自備材料

    1．蒸餾水。

    2．加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。

    3．振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性

    1．避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

    2．實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

    3．不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

  人過敏毒素/補體片斷4(C4a)ELISA試劑盒操作注意事項

    1．試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。

    2．實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。

    3．不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

    4．使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

    5．使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

    6．洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。

    7．底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。

    8．加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。

    9．按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

人過敏毒素/補體片斷4(C4a)ELISA試劑盒樣品收集、處理及保存方法

    1、血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

    2、血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

    3、細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

    4、保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準備

    1．標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：

    400ng/ml（6號標準品）原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。

    200ng/ml（5號標準品）100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液

    100ng/ml（4號標準品）100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    50ng/ml（3號標準品）100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    25ng/ml（2號標準品）100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    12.5ng/ml（1號標準品）100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    0ng/ml（空白對照）原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

    2．洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

人過敏毒素/補體片斷4(C4a)ELISA試劑盒操作步驟

    1．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。

    2．根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。

    3．加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生w物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。

    4．甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

    5．每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

    6．甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

    7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。

    8．取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。

    9．在450nm波長處測定各孔的OD值。

性能

    1.靈敏度：最小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。

    2.特異性：不與人其它細胞因子反應。

    3.重復性：板內、板間變異系數均小于10%。

    4.局限性：6號標準品以上的結果為非線性的，根據此標準曲線無法得到精確的結果。

    結果判斷與分析

    1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

    2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的C4a標準品濃度為橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的C4a含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

    3、檢測值范圍：0-400ng/ml

    4、敏感度：1.0ng/ml