基于分子生物學和重組技術的發展，蛋白質和多肽已經成為一類重要的藥物，但是其穩定性差，生物利用率低，半衰期短等問題也日益受到關注。本文重點介紹了一些新的給藥途徑和給藥系統，例如鼻腔、頰等給藥途徑以及黏膜給藥系統、透皮給藥系統、緩控釋技術等給藥系統的進展。綜述了對于蛋白質和多肽藥物進行定點突變和化學修飾，以達到增加其*性的一些新方法。
關鍵詞：蛋白質；多肽藥物；*性；給藥系統；定點突變；化學修飾elisa試劑盒
由于20 世紀60
年代初固相多肽的合成以及70年代初期重組脫氧核糖核酸技術的產生，以及近年來分子生物學和基因重組技術的提高，蛋白質和多肽越來越廣泛的被應用于臨床，以攻克難以*的疾病。在zui近的一份調查報告中，324
種生物技術藥物(包括臨床試驗或者正在接受管理部門審查的藥物)幾乎覆蓋了150
種疾病，包括癌癥、自身免疫性疾病以及艾滋病等傳染病。這些物質中相當數量都是蛋白質[1]。蛋白質作為藥物的研究雖然取得了快速發展，存在的問題也日益突出，如給藥系統的不完善，穩定性差，在體內半衰期短，生物利用率低等。針對這些問題，科學家基本遵循兩種解決途徑，*是尋找一條蛋白質藥物高生物利用率的給藥途徑；第二是通過化學修飾來優化蛋白質的代謝動力學特性，以延長其半衰期，達到*穩定的目的。
1 影響蛋白質和多肽藥物*性的因素影響蛋白質和多肽藥物*性的主要因素[2]
：(1)當藥物進入系統時，由各種酶引起的代謝，尤其是多種形式的蛋白水解酶的作用，可導致藥物降解為小分子肽或者氨基酸。這類酶廣泛存在于胃、腸道、肝臟和腎臟等器官中[3]，其分布具有細胞組織的特異性。
(2)非蛋白酶因素的影響來源于蛋白質物理或化學上的變化。物理變化包括聚合、沉淀；化學變化包括氨基酸殘基的修飾，主要有氧化作用、還原作用、脫酰胺反應、水解反應、β
消除、二硫化物交換等幾種反應，并且蛋白質在構建中的穩定性和免疫原性以及導致蛋白質化學結構錯誤變化的環境條件也被認為是影響蛋白質代謝穩定性的主要因素。 (3)
較大的多肽常通過受體介導的方式來清除，有不少例子顯示，受體介導的清除可能是一種主要的清除機制。例如胰島素，若減少與受體的親和力就會顯著提高其血漿半衰期。受體介導清除的限速步驟是藥物與細胞表面受體形成非共價物的過程。受體清除具有細胞特異性。
(4)不同的給藥途徑對于藥物的體內分布、代謝過程、生物利用度和藥理作用也具有顯著的影響。成功改造的蛋白質依賴于對其理化和生物學特性的充分了解，包括化學和物理穩定性、免疫原性和代謝動力學特性。蛋白質的治療活性高度依賴于它的構象結構。可是，蛋白質的構象是可變的并且對外在環境十分敏感，這就是說，、設計和處理蛋白質需要特別注重療效和安全性的*化，包括盡可能減少免疫反應[4]。elisa試劑盒
2 給藥系統(drug-delivery
system，DDS)研究進展口服是和zui廣泛適用的給藥途徑，但是這種途徑一般不適用于蛋白質這樣的生物大分子的給藥。蛋白質在胃腸道的內在不穩定性，以及由于較高的相對分子質量和極性表面特性而對生物膜的低滲透性，表明蛋白質在用于全身治療時只能避開胃腸道給藥。科學家還在進行不斷的嘗試，通過選擇不同的給藥途徑達到較高的生物藥效率，如鼻腔或肺部途徑。盡管如此，非胃腸道給藥的生物藥效率很低并且通常不足以達到有效的全身效應。近年來，給藥系統的研究有了十分樂觀的進展，下面介紹幾條目前蛋白質給藥的熱點途徑。
2.1 黏膜給藥系統(mucosal
drug delivery
system)
黏膜給藥系統是使用合適的載體在人體黏膜部位給藥，如鼻黏膜、口腔黏膜、眼黏膜、直腸黏膜、子宮及陰道黏膜，藥物透過黏膜進入體循環產生全身或者局部治療作用的治療方式。黏膜給藥劑型需要具有生物黏附性的輔料，可用作釋藥系統的黏附材料包括天然聚合物，有明膠、脫乙酰殼多糖、凝集素、海藻酸鈉等，還有合成聚合物卡波姆(CP)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)和聚乙二醇(PEG)等。這些聚合物能很好地黏附于水性生物膜上，從而使藥物在病灶部位既能迅速發揮藥效，又能長時間維持藥效。黏膜給藥大大拓寬了許多藥物的給藥途徑，特別是一些多肽類、大分子類藥物。
2.1.1 鼻黏膜給藥 鼻黏膜是黏膜免疫系統的重要部分，鼻腔內含有豐富的血管，經鼻腔接種既可產生黏膜免疫又能產生系統免疫，鼻黏膜給藥因為其吸收面積大，不經過腸循環，生物利用度高等優點，成為蛋白質及多肽藥物的理想給藥途徑之一，如胰島素，在胃腸道中幾乎不能吸收，但卻可通過鼻黏膜、眼黏膜吸收。多年來，對于鼻黏膜給藥劑型的研究較多，如固體粉末制劑、生物黏附性微球、脂質體等，這些新劑型突破*氣霧劑等傳統劑型易被鼻黏膜纖毛清除的缺陷，使藥物在黏膜停留時間長，從而達到*的目的。在對劑型改造的同時，
Kimbell等
[5]對傳統給藥方式也有了新的詮釋。他們研究鼻腔噴霧劑行為，用實驗測量和計算其流體動力學并建立模型，通過了解鼻氣流中離子輸送途徑，設計更有效的噴霧，達到藥物*目的。
2.1.2 頰黏膜給藥以及口服給藥 口腔黏膜給藥具有以下特點：(1)口腔黏膜中的頰黏膜和舌下黏膜部位的血管密集，血流豐富，黏膜組織的通透性僅次于鼻黏膜；(2)與鼻腔給藥和經皮給藥相比，口腔黏膜中酶的活性更低，因此可以有效地避免藥物的降解和代謝；(3)口腔黏膜具有較強對外界刺激的耐受性，當黏膜組織受到制劑中的一些成分產生刺激性和損傷，停止用藥后能夠較好的恢復；(4)劑型易定位，用藥方便，可以隨時撤去藥物，易被患者接受[
6
]。口服疫苗是蛋白質疫苗中比較新的方法，兩種口服疫苗——薩賓口服脊髓灰質炎疫苗和Ty21傷寒疫苗在美國等地被列入疫苗接種計劃。目前，包括艾滋病、炭疽、子宮頸癌、霍亂、胃腸炎、腹瀉和瘧疾等疾病的疫苗都在嘗試口服*[7]。據報道，可溶性蛋白質抗原當口服給藥時可以刺激產生免疫[
8]。口服蛋白質藥物主要采用兩條給藥路線，一是利用生物黏附(bioadhesion)原理[9]，用聚合物材料起定位“平臺”作用，通過黏膜給藥，使制劑具有局部靶向性、*性的雙重特點。Bernkop-Schnurch和Pasta[10]研究表明，通過殼聚糖及其衍生物與酶抑制劑的結合物降低消化酶對蛋白質和多肽類藥物的代謝，可以大大提高胰島素口服生物利用度。二是采用保護的形式，將抗原包被起來，保護性材料可以保護藥物不受胃腸道消化酶的破壞，增加藥物與胃腸道黏膜的緊密接觸，提高生物利用度。2.1.3 肺部吸入給藥 目前對于蛋白質藥物肺部吸入給藥的研究越來越多，很多蛋白質藥物，如亮丙瑞林、胰島素、生長激素可以生理活性型從肺部吸收，生物利用度超過胰島素與生長激素不加促進劑鼻腔給藥系統的生物利用度。Norwood
等[11]
指出，與皮下胰島素注射相比，吸入性人胰島素(Exubera)可提供血糖控制，并且對肺功能只有輕度、可逆的作用，可替代胰島素注射給藥。肺部給藥已取得重大進展，現已進入臨床試驗階段。黏膜給藥系統延長藥物在吸收部位的滯留時間，使藥物與黏膜上皮緊密接觸，改善黏膜上皮吸收差的藥物(如蛋白質多肽類藥物)的吸收情況，提高生物利用度，還有一些生物黏附性聚合物具有抑制蛋白水解酶的作用，為蛋白質藥物給藥開辟新的途徑，近年來已引起人們的廣泛關注和重視。
2.2 透皮給藥系統(transdermal
therapeutic system，TTS；transdermal delivery
system，TDS)
透皮給藥系統是指在皮膚表面*傷給藥，藥物以恒定的速度通過皮膚進入體循環，產生全身或者局部治療作用。透皮給藥系統很有前景，相關制劑已經發展成為數十億美元的工業。患者選擇透皮制劑因為它的方便：不需要按時服用，也沒有任何痛苦，并且可隨時中斷用藥；因為它們的功效，這些制劑同樣受到醫生們的歡迎：它可以避免口服藥產生的并發癥、低吸收率、胃腸道酶對藥物的降解作用以及注射方式帶來的血藥濃度的峰谷現象，尤其解決了蛋白質和多肽藥物在體內易被降解和半衰期短的問題。透皮給藥zui大障礙是皮膚角質層的阻礙，Chen等[12]，用一種基于噬菌體展示的新的高通量的篩選方式，從數以百萬計的多肽中找到一種伴侶，它可運送蛋白質通過皮膚，并發現一個*的序列，并在動物模型中得到證明；它能夠顯著增加胰島素和人生長激素的透皮運輸，不同于以往物理和化學的方法。Chen
等[12]采取生物的方法增加皮膚的通透性，并應用于胰島素和它們的多肽的復合物，增加了大鼠血漿的胰島素水平，降低了血糖水平。透皮運送的人生長激素同樣增強，這說明該方法可廣泛適用。這種分子伴侶使得蛋白質藥物透皮給藥系統的有了激動人心的發展。
2.3 緩控釋技術(controlled
release drug delivery
system)在蛋白質藥物注射給藥系統中，常采用以鑲嵌(entrapment)和包囊(encapsulation)為主要方法的緩控釋技術，包括聚合體給藥系統(
水凝膠、納米膠囊、微球體等)和脂類基礎的給藥系統(脂質體、固體脂質納米粒等)
。緩控釋給藥可減少給藥次數，注射后患者血藥濃度穩定，在體內作用時間長，從而增加藥物*性。水凝膠是交聯的親水聚合物，通過形成三維網絡，對pH、離子強度、溫度等生理性刺激的應答有一定比例的降低[13]，這些都有助于蛋白質釋放的控制。水凝膠物質可以作為微球給藥，或者在原位組成給藥系統。原位組合系統與傳統的微球有許多優勢，給藥方便，復雜性和潛在危險低，在制藥條件方面更適合蛋白質這樣的敏感藥物分子[14]。Bako等[15]將納米復合材料的生物相容性水凝膠(NCHG)，作為局部給藥裝置，用于牙周感染的原位給藥。在水溶液中，納米粒子被自由原子捕獲，引起單體、2
- 羥乙酯(HEMA)和聚乙二醇二甲基(PEGDMA)的共聚作用，由光聚合交聯在一起。之后藥物被包入納米粒子，通過溶脹行為釋藥。研究發現，一般藥物釋放是在24h
內，但是NCHG 對藥物釋放期超過48h，達到*目的。
3 定點突變和化學修飾治療用蛋白質的*性可以通過多種方式的化學修飾來實現。例如，通過突變一個或者多個氨基酸(就是創造一個蛋白質類似物)或者通過糖基化、酰基化或PEG化修飾。這些修飾可以優化蛋白質的代謝動力學特征，但同時，蛋白質的生物學特性也會改變，所以要十分小心。
3.1 定點突變(site-specific
mutagenesis)
人α 干擾素( hIFN-α)提供了一個很好的例子。hIFN-α
是與阻止病毒感染密切相關的蛋白質家族，它可以抑制細胞增殖和調節細胞分化。重組hIFN-α2已被證明可有效治療各種人類病毒性疾病和癌癥。然而，由于其體循環半衰期短，在一段較長時期內必需頻繁給藥。Ceaglio
等[16]利用糖基化策略進行定點突變。將一段N-糖基化共有序列插入到干擾素的不同位置，構成4N 和5N-
干擾素變異體，其大小和帶電量等因素增加，減輕了腎臟對干擾素蛋白質的清除。藥代動力學實驗同時顯示了4N 和5N- 干擾素變異體，與非糖化hIFN-α2
相比，其半衰期增長了25 倍，全身清除率下降到原來的1/20。此外，靜脈注射接種后，4N 類似物無論是在分布還是半衰期，都是非糖化干擾素的11
倍。由此可見定點突變技術可顯著改善蛋白質藥物的藥代動力學性能，延長半衰期。重組人類白介素-2(IL-2)是另一個例子，它的療效是通過基因重組設計實現的。市售非糖IL-2
類似物阿地流津(aldesleukin)是一種人IL-2 脫酰類似物，其中125 位上的半*被*取代。實驗用IL-2 類似物BAY
50-4798(Bayer)是另一種遺傳工程蛋白質，它潛在地提高了IL-2
的*性。
3.2 糖基化修飾(Glycosylation)蛋白質的糖基化是真核生物的一種常見的翻譯后修飾方式。隨著基因工程技術的發展，已有越來越多的藥用重組蛋白被制備，它們多屬于糖蛋白，如重組人促紅細胞生成素(rhEPO)、重組人組織纖溶酶原激活劑(rhtPA)等。蛋白質表面的糖鏈能夠影響蛋白的藥物動力學作用、生物活性、穩定性、對蛋白酶的易感性、水溶性、凝集性、免疫原性等。對于治療性蛋白質，糖基化形式與非糖基化形式相比，可增加血清半衰期，并且糖基化蛋白質對蛋白酶水解作用較不敏感，也具有較強的熱穩定性。用基因工程手段對TNK組織纖維蛋白溶酶原激活劑分子進行糖基化修飾，實驗結果表明，修飾后的蛋白質具有更長的半衰期，并且在急性心梗治療中可以采用低劑量單次快速注射[17]。促紅細胞生成素(EPO)是一種調節紅系祖細胞生長的細胞因子[18]。EPO
是一個高度糖基化的含唾液酸的酸性糖蛋白，由165 個氨基酸組成，其成分約有60%蛋白質和40%糖(重量百分比)。EPO 含3 個N- 糖鏈和1 個O-
糖鏈。研究表明，EPO 的糖基化不影響其體外生物學活性，但卻可延長體內半衰期。由此，Amgen 公司的科學家合成了一種新型的促紅細胞生成蛋白(novel
erythropoiesis stimulating protein，NESP)。與EPO 相比，NESP 在33 和88位各增加了1 個N-
糖基化位點。NESP 的體內半衰期是EPO的3
倍，從而達到了減少用藥次數的目的。
3.3 聚乙二醇化修飾(PEGylation)
通常，PEG修飾通過減少代謝和體循環中受體介導的對蛋白質的吸收，達到降低血漿清除率。PEG修飾同時通過保護性抗原和免疫原也增加了安全性[19]。我們必須了解，PEG
多聚體由許多不同的分子聚合而成，另外，大分子蛋白質中還有很多可以結合PEG的位點。所以無論從效率還是從安全的觀點，由于這種潛在的產物的異質性，PEG
修飾需要進行優化，其中，PEG 定點修飾是近年來比較熱門的方法。2006 年，申請美國的PEG 化粒細胞集落刺激因子(PEG-G-CSF)[20]和PEG
化白細胞介素-10 (PEG-IL-10)[21]便是N端氨基定點修飾產物。急性腹腔注射膽囊收縮素( CCK ) 可誘發顯著的厭食癥，
但這種藥物持續時間短。因此，Verbaeys 等[22]利用膽囊收縮素與相對分子質量為10 000
的聚乙二醇共價配對，形成共軛產物PEGCCK9，然后對其藥物代謝方面做了詳細的記錄，實驗結果表明PEG-CCK9 比未經修飾的CCK9
有著顯著*的厭食癥癥狀。Na 等[23]選用mPEG-SPA 和mPEG- 丁醛(mPEGsuccinimidyl
butyraldehyde)修飾奧曲肽(Octreotide)，其中mPEG- 奧曲肽在體內的半衰期提高了2
倍，而且mPEG-丁醛修飾產物在制備微球過程中有很好的防PLGA(乳酸/
羥乙酸共聚物)酰化作用。
3.4 酰基化修飾(Acylation)
在一些例子中，脂肪酸這樣的化學連接物通過在蛋白質表面暴露殘基可增加蛋白質與血清白蛋白的親和力，從而增加它在血液中的循環時間。酰基化對于小蛋白和多肽更有效，因為它相對更大的增加了蛋白質的疏水性。例如，酰基化人胰島素類似物(B30
酰基化)相較于地特胰島素(insulin
detemir)更加*，并且在一些國家已經通過監管部門的認可。酰基化的原理也同樣成功地運用到了其他蛋白的構建上，如胰高血糖素樣肽1(GLP1)和干擾素α，以及*(*)。然而，酰基化胰島素和GLP1
是位點特異的，而干擾素的酰基化就不那么特異。
4 蛋白質和多肽藥物的前景
由于人們對藥物安全及毒副作用的關注，基因工程藥物的研究也越來越受到重視。經過20多年的努力，我國的基因工程藥物取得了突飛猛進的進展。近年來，隨著多肽和蛋白質結構與功能的不斷明確，很多蛋白質和多肽藥物被研制出來并且進入臨床階段，但是蛋白質和多肽藥物半衰期短，需頻繁給藥，在生理和心理上對患者造成*負擔；而蛋白質和多肽藥物的*性的研究不但解決以上問題，而且使一些由于半衰期短而無法進入應用的藥物獲得很好的治療效果，所以，蛋白質及多肽藥物的研制有著廣泛的前景。
