一、血管內皮細胞的培養方法和特性

人和動脈不同部位、不同血管如大動脈與小動脈、毛細血管，以及靜脈血管之間存在差異，在處理這些細胞時應分別對待。血管內皮細胞形態較小，近似圓形，呈均勻排列，一般取材于人和動物的臍帶。

1．人大動脈內皮細胞培養

人大動脈內皮細胞可來自手術、病理活檢組織，也可來自尸體（需在死后24h內取材），在取材過程中應注意無菌操作。

（1）方法：小心剝除已游離的大血管外膜，置于盛有冷的磷酸鹽平衡鹽溶液平皿中反復漂洗，洗凈血管內、外面的血液和脂質，然后剪開血管，放入37℃消化液中，60min，消化結合后，用23號針頭注射器吸取消化液沖洗血管內腔，zui后收集消化液置無菌試管中，離心（1000rpm 7min）棄上清，加入含血清培養基中，使細胞重新懸并調整細胞數，接種于相應大小培養瓶或培養皿中，37℃恒溫溫箱培養，一周后內皮細胞可長成單層，呈多角形鋪成石狀排列。

（2）注意事項：①如果小于23號針頭則回收內皮細胞效果差，若針頭過大則注射器內壓大會吸入緊貼內皮細胞的平滑肌細胞，因此注意使用恰當的針頭；②人血管內皮細胞對營養條件要求高，是依賴于生長因子的一種細胞。常用的培養基為RPMI 1640，培養時添加15% FBS，15%Nu-Serum，5～20μg/ml的內皮細胞生長因子（ECGF）以及100μg/ml的肝素。改進的培養基有MCDB109培養基，市場上也有內皮細胞商品培養基，可根據需要選擇購買；③培養基中必須加入相應抗生素，zui終濃度：慶大霉素為15μg/ml，氨芐青霉素為50μg/ml，二性霉素B1～2μg/ml，二甲胺四環素1μg/ml。在48h內可以防止細胞感染，3日后還應添加慶大毒素。此方法也適用于人大靜脈內皮細胞的培養，但靜脈壁薄，操作困難，細胞容易老化。

2．高度動脈硬化的血管內皮細胞的培養動脈硬化血管內皮細胞培養，對培養基的要求同正常內皮細胞，技術關鍵是分離細胞。動脈硬化內皮細胞層混有脂肪斑化，粥樣腫脹的巨噬細胞。除去這種巨噬細胞zui有效的方法是利用內皮細胞和巨噬細胞比重的差異，通過離心的方法達到分離的目的。通常用淋巴細胞分離液，首先經消化液處理，將所得內皮細胞的沉渣放入不含血清的8mlRPMI 1640液再漂浮后，預先在另一試管加入5ml淋巴細胞分層液（比重1.0717），再將細胞輕輕加入。加完后，800xg，23℃離心30min，內皮細胞沉著于管底，巨噬細胞漂浮于上層。

3．臍帶靜脈內皮細胞培養

在嬰兒出生時立即將臍帶放置于無菌的500ml磷酸鹽溶液（PBS）中低溫保存。次日分離細胞。臍帶有一根靜脈兩根動脈，通常用內腔大靜脈。將洗凈的靜脈一端用夾子夾緊，一端注入消化液，靜置孵育片刻。然后PBS或培養液反復抽吸內腔，收集后與消化液一并離心、沉淀內皮細胞。所用培養基與大動脈內皮細胞培養基相同，臍帶靜脈內皮細胞、大動脈內皮細胞易于培養，既使不加生長因子在zui初幾代細胞也會增殖良好。

二、血管內皮細胞特性

1．血管內皮細胞重要標志

（1）第Ⅷ因子關連抗原（von willebrand factor,VWF），可以由全身所有血管內皮細胞產生，檢測這一因子主要用相應抗體。VWF有其特異性，人的VWF抗體對牛的內皮細胞沒有交叉反應。兔疫熒光間接法測定該因子，陽性細胞出現細長的熒光顆粒，在核周圍的顆粒較密，細胞邊緣顆粒較少。

（2）Weibel-Palade小體，該小體是血管內皮細胞又一特異性的標志。電子顯微鏡下，呈現0.1～0.3μm,長0.5～5μm的橢圓形棒狀結構。上述的VWF就是該小體產生的。

2．培養的大動脈內皮細胞形態

培養的內皮細胞從形態學上可分為兩類。其一，占培養內皮細胞的大部分，直徑在50～70μm，類圓形或多角形的小型細胞，這一類被稱為典型內皮細胞，呈單層鋪路石樣排列，占嬰幼兒、青少年血管內皮細胞的大部分。另一類是直徑在100～200μm的大型內皮細胞，這類細胞通常帶有兩個以上的細胞核，被稱為非典型內皮細胞。非典型內皮細胞是成人的大動脈內皮細胞，與動脈硬化和老化有關。

一般來說，血管內皮細胞隨著年齡的增加，使典型的內皮細胞慢慢地轉變為非典型內皮細胞；年齡越大，非典型的內皮細胞含量越高。細胞生長方面，動脈內皮細胞比靜脈內皮細胞增殖能力強，嬰幼兒血管內皮細胞比成人或高齡者內皮細胞生長能力強，體外培養的這兩種細胞與對照組細胞間存在顯著差異。