其原理為利用酶標記的抗抗體，以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法作。間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。

      因此在間接法中，抗原包被后一般用無關蛋白質(例如牛血清蛋白)再包被一次，以封閉(blocking)固相上的空余間隙。另外，在檢測過程中標本須先行稀釋(1:40~1:200)，以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。

步驟如下：

1，將特異性抗原與固相載體聯結,形成固相抗原.洗滌除去未結合的抗原及雜質。

2，加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。

3，加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體.固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。

4，加底物顯色本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。間接法成功的關鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，例如以E。Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E，Coli成份,很可能與受過E。Coli感染者血甭中的抗E。Coli抗體發生反應。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原, 如不將其中的Ig去除，試驗中也發生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果。