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在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA試劑盒反應總是需要一定時間的溫育。ELISA試劑盒屬固相免測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐，因此需經擴散才能達到反應的終點。
溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。在建立ELISA試劑盒方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時，產物的生成可達。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應4℃更為，在放射免測定中多使反應在冰箱中，以形成*多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA試劑盒中一般不予采用。
ELISA試劑盒保存條件：
1.未開封的試劑盒:
所有試劑均按試劑瓶標簽上所示保存。請注意，收到試劑盒后請盡快將標準品、檢測溶液A、檢測溶液B以及96孔板保存于-20℃。
2.使用后的ELISA試劑盒：
剩余試劑仍需按照試劑瓶標簽所示的溫度保存，開封后的酶標板要加干燥劑后密封保存于-20℃，避免潮濕。
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