在現在的ELISA試劑盒商品試劑盒中，必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。注意的關鍵點是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區，易導致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產生污染。出現氣泡則反應液界面有差異。所以，有時候一份標本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。

       溫育是ELISA試劑盒測定中影響測定成敗為關鍵的一個因素。ELISA試劑盒作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結合反應在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原結合，必須在一定的溫度條件下反應一定的時間。溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。一些操作者，擅自改變說明書操作，使用自己喜歡的溫育時間和溫育溫度，這樣造成一些不必要的麻煩。因為，不同試劑盒有不同的溫育時間和溫育溫度的選擇，隨意更改溫育時間或者溫育溫度將導致試驗結果出現偏差。

       比色要注意波長的選擇。以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為450nm，后者為492nm，濾光片需根據要求隨時更換。因此，容易出現濾光片錯用的問題。

       其次，單波長或雙波長比色選擇的問題。所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有大吸收的波長進行比色測定；而雙波長雙色則酶標儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次，敏感波上下的吸光度測定值為樣本測定酶反應特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶反應特異顯色的吸光度值為零，此時測得的吸光度即為臟物的吸光度值。酶標儀給出的數值為敏感波長下的吸光度值與非常感波長下的吸光度值的差。因此，雙波長比色測定具有能排除由微滴板本身、板孔內標本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的優點。由于ELISA試劑盒測定中單個空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，故而在ELISA試劑盒測定比色時，是使用雙波長比色。