2024年08月05日 09:27上海遠慕生物科技有限公司點擊量：417
一、實驗原理
真核生物的一切有核細胞（包括培養細胞）都能用來制備基因組 DNA。真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細胞核內，因此，制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般過程是將分散好的組織細胞在含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質，得到的DNA溶液經乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應體系中，SDS可破壞細胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離，EDTA則抑制細胞中Dnase的 活性；而蛋白酶K可將 蛋白質降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。
二、儀器及試劑
1. 儀器：
恒溫水浴鍋、臺式離心機、紫外分光光度計（GeneQuant）、移液器、玻璃勻漿器、離心管（滅菌）、吸頭（滅菌）
2. 試劑：
（1）細胞裂解緩沖液：
Tris (pH8.0) 100 mmol/L
EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L
NaCL 20 mmol/L
SDS 10%
胰RNA酶 20ug/ml
（2） 蛋白酶K： 稱取20mg蛋白酶k溶于1ml滅菌的雙蒸水中，?C20℃備用。
（3）TE緩沖液（pH 8.0）：高壓滅菌，室溫貯存。
（4）酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）
（5）異丙醇、冷無水乙醇、70%乙醇、滅菌水。
三、操作步驟
1. 取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g（12.5px3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數次。于臺式離心機以12000 rpm離心5min，取上清液入另一離心管中。
2.加2倍體積異丙醇，倒轉混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進行PCR反應等，需要進一步純化的按下列步驟進行）
3.加等量的酚?氯仿?異戊醇振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。
4.取上層溶液至另一管，加入等體積的氯仿?異戊醇，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。
5. 取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L乙酸氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min ，離心12000 rpm ,10min。
6.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。
7.用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm ， 5min。
8.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。
9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存備用。
10.吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。
四、常見問題
1.選擇的實驗材料要新鮮，處理時間不易過長。
2.在加入細胞裂解緩沖液前，細胞必須均勻分散，以減少DNA團塊形成。
3. 提取的DNA不易溶解：不純，含雜質較多；加溶解液太少使濃度過大。沉淀物太干燥，也將使溶解變得很困難。
4. 電泳檢測時DNA成涂布狀：操作不慎；污染核酸酶等。
5.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不純，含有蛋白質等雜質。在這種情況下，應加入SDS至終濃度為0.5%，并重復步驟2～8。
6.酚/氯仿/異戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高濃度的DNA，可加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織的量。
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