甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)有不少優(yōu)點(diǎn)，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表達(dá)系統(tǒng)zui為人熟知，并廣泛應(yīng)用于外源蛋白的表達(dá)。雖然說酵母表達(dá)操作簡單表達(dá)量高，但是在實(shí)際操作中，并不是每個(gè)外源基因都能順利得到高表達(dá)的。不少人在操作中會遇到這樣那樣的問題，收集了部分用戶在使用EasySelect Pichia Expression System這個(gè)被譽(yù)為zui簡單的畢赤酵母表達(dá)的經(jīng)典試劑盒過程中的心得體會。其中Xiang Yang是來自美國喬治城大學(xué)（Georgetown University）Lombardi癌癥中心（Lombardi Cancer Center），部分用戶來自國內(nèi)。

+ 表示優(yōu)勝于；- 表示不如；= 表示差不多

EasySelect Pichia Expression System

產(chǎn)品性能：

優(yōu)點(diǎn)――使用簡單，表達(dá)量高，His-tag便于純化

缺點(diǎn)――酵母表達(dá)蛋白有時(shí)會出現(xiàn)蛋白切割問題

全面產(chǎn)品報(bào)告及心得體會：

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種能表達(dá)重組蛋白的酵母品種，一方面由于其是屬于真核生物，因此表達(dá)出來的蛋白可以進(jìn)行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生長速度快，可以將表達(dá)的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，方便蛋白純化。

畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ在多克隆位點(diǎn)（MCR）3'端帶有his-tag和c-myc epitopes，這些tag有利于常規(guī)檢測和純化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表達(dá)，并且在表達(dá)后α-factor可以自動被切除。在進(jìn)行克隆的時(shí)候，如果你選擇的是EcoRI，那么只需在目標(biāo)蛋白中增加兩個(gè)氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列選用的是Zeocin抗生素作為篩選標(biāo)記，而誘導(dǎo)表達(dá)的載體需要甲醇――甲醇比一般用于大腸桿菌表達(dá)誘導(dǎo)使用的IPTG便宜。

*步――構(gòu)建載體

Xiang Yang：pPICZ系列有許多克隆位點(diǎn)可供選擇，同時(shí)也有三種讀碼框以便不用的用戶需要。

紅葉山莊：有關(guān)是選擇pPIC9K還是pPICZ系列？pPIC9K屬于穿梭質(zhì)粒，也可以在原核表達(dá)，而pPICZ系列比較容易操作，大腸和畢赤酵母均用 抗Zeocin篩選（PIC9K操作麻煩一點(diǎn)，大腸用amp抗性，而畢赤酵母先用His缺陷篩選陽性克隆，在利用G418篩選多拷貝），而且對于大小合適（30―50KD）的蛋白在產(chǎn)量上是pPIC9K*的。

leslie：要做畢赤酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)，首先當(dāng)然就要了解這個(gè)可愛的酵母了（橢圓形，肥嘟嘟的，十分可愛），她和大腸桿菌長得有較大區(qū)別（大腸桿菌是桿狀的），因此在培養(yǎng)的過程中要區(qū)別這兩種菌體，除了氣味，濃度，顏色以外，也可以取樣到顯微鏡中觀測。大家做畢赤表達(dá)的時(shí)候應(yīng)該都遇過這種情況吧，表達(dá)過程中染菌（我們實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)污染過各種顏色形狀的細(xì)菌，那真是一段可怕的經(jīng)歷），如果在不知情的情況下繼續(xù)做下去，那可以就是浪費(fèi)大把的時(shí)間了。

基本熟悉了畢赤酵母，了解了她生長的喜好（多糖偏酸環(huán)境），生長的周期等等情況后，當(dāng)然更多的精力還是應(yīng)該花在表達(dá)的目的蛋白上，我的表達(dá)蛋白有些恐怖，有100KD，本來當(dāng)然應(yīng)該放在大腸桿菌中表達(dá)，但是為了分泌表達(dá)（其實(shí)后來發(fā)現(xiàn)大腸桿菌pET系列分泌表達(dá)系列也不錯(cuò)）和糖基化修飾（主要是這個(gè)方面，因?yàn)槲业牡鞍资侨嗽吹模磉_(dá)出來用于酵母雙雜，因此需要有完備的糖基化修飾）。這樣我的DNA片段由于較長，所以在做克隆的時(shí)候也要非常小心，需要注意的是：

①酶切位點(diǎn)不能出現(xiàn)在目的DNA段中――如果片段長無法避免，可以采用平末端連接；

②雖然α-factor可以自動切除，但是在設(shè)計(jì)表達(dá)的時(shí)候，如果在N端不能出現(xiàn)任何多余的aa（比如藥物蛋白表達(dá)），需要特別留意（說明書上有詳細(xì)說明：P13）；

③有三種不同的讀碼框（對于pPICZα系列來說就是對上α-factor序列），在設(shè)計(jì)克隆的時(shí)候要反復(fù)確定自己的讀碼框是否正確，這可是致命的問題；

④無論pPICZ還是pPICZα都有TGA（終止密碼子），但是pPICZ系列沒有ATG（起始密碼子），有人認(rèn)為酵母啟動子與外源基因的ATG之間的距離越短對于表達(dá)的該基因越有利；

⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入終止密碼子；

⑥Pichia的密碼子與釀酒酵母的相似，有關(guān)基因表達(dá)偏好密碼子的問題有人認(rèn)為沒有必要更換，有人認(rèn)為一定要換，個(gè)人認(rèn)為以產(chǎn)量為主要目的的可以考慮更換基因密碼子，而如果片段過長就比較麻煩，不過有許多真核保守蛋白其實(shí)是和酵母密碼子相似的；

⑦克隆菌株需要有recA，endA，試劑盒帶有的*0挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意帶有篩選抗生素Zeocin的培養(yǎng)基要用低鹽培養(yǎng)基（NaCl減半），這主要是因?yàn)榕掠绊懙娇股刈饔茫╖eocin平板要避光保存）；

⑧測序引物可以用α-factor信號引物，也可以用5'AOX1引物；

⑨如果需要高量表達(dá)，可以考慮做克隆的時(shí)候串聯(lián)基因片段進(jìn)行表達(dá)，另外也可以在轉(zhuǎn)化酵母的時(shí)候重復(fù)轉(zhuǎn)化。

⑩目的基因中不要含有pro-glu-ser-thr這樣的序列，因?yàn)檫@個(gè)序列是激活蛋白水解酶的作用底物，會影響表達(dá)，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x這樣的序列（x=任何氨基酸），因?yàn)檫@些序列容易受到容酶體的切割，而且目的蛋白末端是ala,asp,val,ser這樣的氨基酸。除此之外許多高A+T含量的基因通常會由于提前終止而不能有效轉(zhuǎn)錄，也需要多加注意。