摘 要：本文旨在介紹使用軟件設計PCR引物的技巧。在pcr引物設計原則的基礎上，詳細介紹了兩種常用引物設計軟件的基本使用方法，并對其各自的優缺點進行了比較。一般性引物自動搜索可采用“Premier Primer 5”軟件，而引物的評價分析則可采用“Oligo 6”軟件。
關鍵詞：PCR；引物設計

To design PCR primers with oligo 6 and Primer Premier 5
Zhang Xinyu, Zhu Youkang, Gao Yanning
(Cancer Institute, Chinese Academy of Medical sciences,Beijing,100021,China)
Abstract: The skill of PCR primer design with software is introduced in this paper. Based on the principal of PCR-primer design, the usage of two kinds of popular primer-design software was reviewed detailedly, including their merit, demerit and usage skills. It is recommended that to use Premier Primer 5 does the usual automatic primers search, but Oligo 6 primers analysis.
Key Words: PCR primer; design; usage skill;

自從1985年Karny Mullis發明了聚合酶鏈式反應以來，PCR技術已成為分子生物學研究中使用zui多、zui廣泛的手段之一[1] ，而引物設計是PCR技術中至關重要的一環。使用不合適的PCR引物容易導致實驗失敗：表現為擴增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。
現在PCR引物設計大都通過計算機軟件進行。可以直接提交模板序列到特定網頁，得到設計好的引物，也可以在本地計算機上運行引物設計專業軟件。一般來說，專門進行PCR引物設計的專業軟件功能更為強大，但使用起來卻不太容易。本文將就引物設計原則及軟件使用問題進行探討。

1. 引物設計的原則
引物設計有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。
具體實現這3條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度（primer length），產物長度（product length），序列Tm值 (melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內部穩定性(internal stability, 用ΔG值反映)，形成引物二聚體(primer dimer)及發夾結構（duplex formation and hairpin）的能值，在錯配位點（false priming site）的引發效率，引物及產物的GC含量（composition），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內切酶位點，引進突變等。根據有關參考資料和筆者在實踐中的總結，引物設計應注意如下要點：
1. 引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進行反應[2] 。
2. 引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現3個以上的連續堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發機率增加[2] 。
3. 引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基A[3][4]。另外，引物二聚體或發夾結構也可能導致PCR反應失敗。5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物[2] 。
4. 引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。
5. 引物所對應模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復性條件zui。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是zui鄰近法(the nearest neighbor method) [6][7] 。
6. ΔG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性。應當選用3’端ΔG值較低（值不超過9），而5’端和中間ΔG值相對較高的引物。引物的3’端的ΔG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA聚合反應[6] 。
7. 引物二聚體及發夾結構的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行[8]。
8. 對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據下一步實驗中要插入PCR產物的載體的相應序列而確定。
值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。

摘 要：本文旨在介紹使用軟件設計PCR引物的技巧。在pcr引物設計原則的基礎上，詳細介紹了兩種常用引物設計軟件的基本使用方法，并對其各自的優缺點進行了比較。一般性引物自動搜索可采用“Premier Primer 5”軟件，而引物的評價分析則可采用“Oligo 6”軟件。
關鍵詞：PCR；引物設計

To design PCR primers with oligo 6 and Primer Premier 5
Zhang Xinyu, Zhu Youkang, Gao Yanning
(Cancer Institute, Chinese Academy of Medical sciences,Beijing,100021,China)
Abstract: The skill of PCR primer design with software is introduced in this paper. Based on the principal of PCR-primer design, the usage of two kinds of popular primer-design software was reviewed detailedly, including their merit, demerit and usage skills. It is recommended that to use Premier Primer 5 does the usual automatic primers search, but Oligo 6 primers analysis.
Key Words: PCR primer; design; usage skill;

自從1985年Karny Mullis發明了聚合酶鏈式反應以來，PCR技術已成為分子生物學研究中使用zui多、zui廣泛的手段之一[1] ，而引物設計是PCR技術中至關重要的一環。使用不合適的PCR引物容易導致實驗失敗：表現為擴增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。
現在PCR引物設計大都通過計算機軟件進行。可以直接提交模板序列到特定網頁，得到設計好的引物，也可以在本地計算機上運行引物設計專業軟件。一般來說，專門進行PCR引物設計的專業軟件功能更為強大，但使用起來卻不太容易。本文將就引物設計原則及軟件使用問題進行探討。

1. 引物設計的原則
引物設計有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。
具體實現這3條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度（primer length），產物長度（product length），序列Tm值 (melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內部穩定性(internal stability, 用ΔG值反映)，形成引物二聚體(primer dimer)及發夾結構（duplex formation and hairpin）的能值，在錯配位點（false priming site）的引發效率，引物及產物的GC含量（composition），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內切酶位點，引進突變等。根據有關參考資料和筆者在實踐中的總結，引物設計應注意如下要點：
1. 引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進行反應[2] 。
2. 引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現3個以上的連續堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發機率增加[2] 。
3. 引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基A[3][4]。另外，引物二聚體或發夾結構也可能導致PCR反應失敗。5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物[2] 。
4. 引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。
5. 引物所對應模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復性條件zui。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是zui鄰近法(the nearest neighbor method) [6][7] 。
6. ΔG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性。應當選用3’端ΔG值較低（值不超過9），而5’端和中間ΔG值相對較高的引物。引物的3’端的ΔG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA聚合反應[6] 。
7. 引物二聚體及發夾結構的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行[8]。
8. 對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據下一步實驗中要插入PCR產物的載體的相應序列而確定。
值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。