在一項新的研究中，來自瑞士蘇黎世聯邦理工學院和挪威卑爾根大學的研究人員開發出一種方法，使得他們能夠*詳細研究大型蛋白復合物的組裝過程。作為他們的案例研究，他們選擇了大的細胞復合物之一：酵母細胞中的核孔復合物。

細胞會產生大量的蛋白復合物，每個復合物都是由許多單個蛋白組成的。這些蛋白復合物，比如核糖體，調節細胞中幾乎所有維持生命的生物功能。

生物學家們已經成功地確定了許多這些復合物的結構，但是迄今為止，關于單個蛋白如何組裝在一起并隨時間變化的研究較少。迄今為止，傳統的方法已被證明不足以研究這些反應在細胞中的確切過程，特別是涉及到大型蛋白復合物時。

他們的方法使得跟蹤蛋白復合物組裝的動態變化成為可能，即使是非常大的蛋白質復合物，也有很高的時間分辨率。

受代謝分析的啟發

這些研究人員將他們的新方法稱為KARMA（kinetic analysis of incorporation rates in macromolecular assemblies, 高分子組裝中摻入速率的動力學分析），該方法是基于研究代謝過程的方法構建出來的。研究代謝的科學家們長期以來一直在他們的研究工作中使用放射性碳，例如，標記葡萄糖分子，然后細胞吸收并代謝放射性碳。這種放射性標記使得人們能夠追蹤葡萄糖分子或其代謝物出現的位置和時間點。

Weis解釋說，“這種類型的研究啟發我們將類似的原理應用于探索蛋白復合物組裝過程中發生的反應。”

在他們的方法中，這些研究人員使用標記的氨基酸進行研究，這些氨基酸是蛋白的基本構成元件，含有較重的碳和氮同位素。在酵母細胞的培養物中，他們用較重的氨基酸替代較輕的氨基酸。酵母菌在蛋白合成中使用這些較重的氨基酸，從而使所有新產生的蛋白的分子量發生變化。

復合物組裝的時間尺度

為了分離蛋白復合物，這些研究人員每隔一段時間就從培養物中取出酵母細胞，并采用質譜儀測量具有較重氨基酸的分子和不具有較重氨基酸的分子之間的微小重量差異。這表明了蛋白復合物中蛋白的年齡。基本上而言，年齡越大的蛋白，它被整合到復合物中的時間越早。基于這些年齡差異，他們應用動力學狀態模型終重建了特定蛋白復合物的精確組裝順序。

作為驗證這種新方法的案例研究，Weis和他的團隊選擇了酵母細胞中的核孔復合物。這種結構大約有500到1000個組件，由大約30種不同的蛋白組成，每種蛋白都有多個拷貝，因此它是已知大的蛋白復合物之一。

利用KARMA，這些研究人員能夠獲得說明哪些組件被整合到這種結構以及何時整合的詳細圖譜。他們的發現之一是層次原理（hierarchical principle）：單個蛋白在很短的時間內形成亞基，然后按照特定的順序從中心向外圍組裝。

耐用的內部支架

Weis說，“我們*證實，一些蛋白在組裝核孔復合物的過程中非常快地發生整合，而其他蛋白則在大約一個小時后才被整合進去。這是一個令人難以置信的漫長時間。”酵母細胞每90分鐘分裂一次，這意味著幾乎需要整整一代人的時間才能完成這個重要的核孔復合物的組裝。確切地講，為什么新核孔的組裝需要如此長的時間與酵母菌的繁殖周期有關，目前尚不清楚這一點。

這些研究人員還發現，一旦核孔組裝完成，核孔復合物在內部支架中的的各個部分是高度穩定和耐用的，在其生命周期內幾乎沒有任何組件被替換。相比之下，核孔復合物外圍的蛋白則經常被替換。

有缺陷的核孔促進疾病發生

核孔是細胞中重要的蛋白復合物之一，這是因為它們負責細胞核和細胞質之間的物質和分子交換。例如，它們將信使RNA從細胞核運送到細胞核外的細胞機器，而這些細胞機器需要這些分子作為制造新蛋白的藍本。

此外，核孔在人類疾病中起著直接和間接的作用。相應地，核孔及其蛋白的變化會影響白血病、糖尿病或阿爾茨海默病等神經退行性疾病的產生。Weis說，“不過一般來說，核孔缺陷導致這些疾病模式的原因還不是很清楚。”他解釋說，KARMA可能有助于在未來更深入地了解這類問題。

多功能平臺

Weis說，“雖然我們在這項研究中只將KARMA應用于一種蛋白復合物，但是我們對其未來的應用感到興奮。我們的方法如今將使我們能夠破譯一系列生物過程發生的順序。例如，他們的技術可用于研究病毒（如SARS-CoV-2）感染周期中發生的分子事件，并有可能幫助找到破壞該感染周期的新候選藥物。”

這種新方法還可以應用于除蛋白以外的其他生物分子，如RNA或脂類