當顆粒性抗原與其相應抗血清混合時,在有一定濃度的電解質環境中,抗原凝集成大小不等的凝集塊,叫做凝集反應。
凝集反應廣泛地應用于疾病的診斷和各種抗原性質的分析。即可用已知免疫血清來檢查未知抗原,亦可用已知抗原檢測特異性抗體。
一.直接凝集反應
顆粒抗原與抗體直接結合出現凝集現象叫直接凝集反應。
(一)玻片凝集反應
材料:
1.診斷血清:1:10稀釋的傷寒桿菌診斷血清
2.菌種:傷寒桿菌、痢疾桿菌24小時瓊脂斜面培養物
3.生理鹽水、載玻片、毛細吸管
方法:
1.取清潔玻片一張,用蠟筆劃為三格,并注明號碼。無菌操作下,用接種環于1、2格內加1:10稀釋傷寒桿菌診斷血清1-2滴,第三格加1-2滴生理鹽水。
2.無菌操作下,用接種環取傷寒桿菌培養物少許,混于第三格中,再混于*格中(不能先混*格再混第三格,因為這樣將使診斷血清混入鹽水而影響對照結果),將細菌與鹽水或血清混合均勻使呈乳狀液。此時取菌量不可過多,使懸液呈輕度乳濁即可。
3.同法取枯草桿菌培養物少許,于第二格內混勻。
4.輕輕搖動玻片,經1-2分鐘后肉眼觀察,出現乳白色凝集塊者,即為陽性反應;仍為平等的乳濁液者,即為陰性反應。如結果不夠清晰,可將玻片放于低倍顯微鏡下觀察。
(二)試管凝集反應
為一種定量試驗,用已知抗原檢查血清中有無特異抗體,并測定其相對含量。
材料:
1.診斷血清1:10稀釋傷寒桿菌“H”血清,1:10稀釋傷寒桿菌“O”血清。
2.菌液:傷寒桿菌“H”菌液,傷寒桿菌“O” 菌液。
3.生理鹽水,小試管,吸管。
方法:
1.取潔凈小試管14只分兩排排列于試管架上,每排7只依次用蠟筆注明號碼,于每管中分別加入0.5毫升生理鹽水。
2.在第1排1管中加入1:10稀釋傷寒H血清0.5毫升,于管內連續吹吸3次,使血清與鹽水充分混合,而后吸出0.5毫升注入第2管,同樣予以混勻后吸出0.5毫升注入第3管。依次類推,稀釋到第6管,自第6管吸出0.5毫升棄去。此時,自第1管至第6管的血清稀釋倍數為1:20,1:40,1:80,1:160,1:320,1:640。第7管不加血清作為對照。
3.同法用吸管吸取1:10稀釋傷寒桿菌O血清加入第2排第1管,并依次如上法予以稀釋。
4.用移液管吸取傷寒桿菌H菌液,加收第1排各管中每管0.5毫升(由鹽水對照管開始,依次由后向前加入)此時血清稀釋倍數又增加了一倍。
5.同法于第2排各管中加入傷寒O菌液0.5毫升。
6.將各管振蕩混勻,放37℃水浴箱中2—4小時或37℃孵育箱中過夜次日取出觀察
結果。
觀察結果:
1.觀察切勿搖動試管,以免凝集塊分散。
2.先看對照管,此管應無凝集現象,管內液體仍成混濁狀態。但如放置時間較長,細菌堆于管底成小圓點狀,為陰性反應。
3.試驗管應自第1管看起,如有凝集時則于管底有不同大小的圓片狀邊緣不整齊的凝集物,上清則澄清透明或不同程度混濁。凝集的強弱可用“+”號表示如下:
“++++”凝集很強,管內液體*澄清,凝集塊*沉于管底;
“+++”凝集強,管內液體不*澄清稍有輕度混濁,凝集塊沉于管底;
“++”凝集中等強度,液體半澄清,凝集塊沉于管底;
“+”凝集弱,管內液體混濁,少量凝集塊沉于管底;
“-”不凝集,管內液體和對照管同樣混濁,無凝集塊。
4.輕輕振蕩各管,觀察凝集塊的狀態,對照管的細菌在振蕩時呈煙霧狀上升,隨即消散,細菌分散仍呈混濁狀態。“H”菌液的凝集塊疏松呈棉狀,大片沉于管底輕搖即升起,并極易破碎。“O”菌液凝集呈緊密顆粒狀,沉于管底堅實致密,輕輕振搖不易升起,凝集顆粒較小不易搖碎。
5.記錄觀察的結果并制定凝集效價。通常以能產生明顯凝集(++)的血清大稀釋倍數作為該血清的凝集效價。如血清的zui低稀釋度(即第1管1:40)仍無凝集應報告為低于1:40。如血清的zui高稀釋度(即第6管1:1280)仍顯*凝集現象。,應報該血清效價高于1:1280。
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