腦微血管內皮細胞是構成血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的重要成分，與外周血管內皮細胞不同，它具有高跨內皮阻抗（transendothelial electrical resistance，TER）、細胞間緊密連接、極少的胞飲小泡、缺乏窗孔結構以及含有選擇性雙向跨細胞膜轉運系統等*的特征，從而使血腦屏障形成一個限制大多數極性分子和蛋白質運動的選擇性低滲透性的屏障[1]。由于體外培養的腦微血管內皮細胞保持了較多的其體內固有的特點[1]，因此目前腦微血管內皮細胞體外培養模型已被廣泛應用于血腦屏障的研究、腦血管疾病的病理生理及分子生物學研究、新藥篩選、腦微血管內皮細胞生理生化及藥理學研究等領域。而大多數體內實驗采用大鼠為動物模型，而且大鼠具有較多的細胞生物學研究所需的抗體可用，因此進行大鼠腦微血管內皮細胞的培養具有重要的意義。自從Panula等[2]成功培養大鼠腦微血管內皮細胞以來，國內外有關大鼠腦微血管內皮細胞的分離和培養方法已有較多的報道，我們發現國內的方法多以組織勻漿、兩次尼龍網過濾分離腦微血管段為主[3,4]，也有采用酶消化、梯度離心及尼龍網過濾的[5]，但細胞得率均較低，而近些年來國外大多數方法采用以大腦皮質為材料、酶消化及梯度離心分離腦微血管段并進行原代培養[6~9,11,12]。由于原代培養中無法避免地混雜成纖維細胞、周細胞、平滑肌細胞、星型膠質細胞等其他細胞的生長，而且工作量大、過程繁瑣且費用高[1]，進行較純的大鼠腦微血管內皮細胞原代培養一直是國內外的一個難點。

本人參照文獻[6]、[7]、[8]的方法，成功地摸索出大鼠腦微血管內皮細胞分離和原代培養的方法，并獲得純度較高的腦微血管內皮細胞。

1.材料與方法

1.1 實驗動物

每次實驗采用10只2-3周齡SD大鼠，雌雄均可，體重40~60 g。

1.2 試劑

纖連蛋白（fibronectin），Ⅳ型膠原，鼠尾膠，葡聚糖（dextran，分子量100~200kDa），DNA酶Ⅰ（DNaseⅠ）購自Sigma公司；D-Hanks液，PBS，10×PBS按配方自制；Ⅱ型膠原酶購自Worthington公司；明膠，牛血清白蛋白（BSA），HEPES購自Amresco公司；Percoll購自Amersham Biosciences；DMEM（高糖）購自Gibco BRL公司；肝素鈉，NaHCO3購自中國醫藥集團上海化學試劑公司；青、鏈霉素購自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清（FBS）購自PAA Laboratories；堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），膠原酶/分散酶（collagenase/dispase）購自Roche公司。

1.3 重要儀器

低溫離心機（1 Centrifuge 5810 R，購自Eppendorf；2 himac CR 22F，購自Hitachi）

1.4 試劑配制

1mg/ml鼠尾膠（用0.2%乙酸配制），1%明膠（用D-Hanks液配制），1%Ⅱ型膠原酶（用DMEM配制，用時稀釋成0.1%的濃度），1%膠原酶/分散酶（用DMEM配制，用時稀釋成0.1%），15%葡聚糖（用PBS配制），20%BSA（用DMEM配制，調pH值至7.4后用0.45 um濾膜過濾除菌，較難過濾！），DNase Ⅰ（用冷PBS配制成2 U/ul），以上試劑經0.22 ?m濾膜過濾除菌后分裝保存于-20 ℃；50%Percoll(配12 ml,需6 ml Percoll原液, 0.67 ml 10×PBS, 0.4 ml FBS，4.93 ml PBS)；DMEM培養液（含4000 mg/L D-葡萄糖，4 mmol/L L-谷氨酰胺，添加3.7 g/L NaHCO3，20 mmol/L HEPES，肝素鈉 100 mg/L，青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100 ug/ml），pH值調至7.4，過濾除菌后分裝保存于4 ℃，用時加入20%FBS，1 ng/ml bFGF。

1.5 培養皿處理

涂布3種不同的基質：培養前一天加入1 ml 1%明膠于35mm塑料培養皿，置于37 ℃培養箱過夜，接種前用D-Hanks液漂洗2次；接種前4 h，加入鼠尾膠6~10 ug/cm2，在密閉的器皿里用氨氣熏5~10 min后，置于室溫1~2 h晾干后，用D-Hanks液漂洗2次；50ul 0.1%纖連蛋白、50ul 1 mg/ml Ⅳ型膠原和400ul雙蒸水混合后，加入到每個培養皿中涂布均勻后吸出，可涂布10個培養皿，置于37 ℃培養箱1~2 h晾干后，用D-Hanks液漂洗2次。