菌落PCR（Colony PCR）可不必提取基因組DNA，不必酶切鑒定，而是直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進行PCR擴增，省時少力。建議使用載體上的通用引物。通常利用此方法進行重組體的篩選或者DNA測序分析。zui后的PCR產(chǎn)物大小是載體通用引物之間的插入片斷大小。

具體方法：

1、PCR混合物的制備

taq buffer（10×） 20 ul

dNTP（2.5 mM） 5 ul

primer Forward（50 mM） 10 ul

Primer Reverse（50 mM） 10 ul

ddH2O 147 ul

Taq（2U/ul） 8 ul

total 200 ul

將上述溶液混勻，10 ul每管分裝于200 ul pcr管中。

2、常溫下隨機挑選轉(zhuǎn)化板上的轉(zhuǎn)化子，用滅菌的牙簽或槍頭挑取少量菌體，在LB瓊脂糖平板上輕點，做一拷貝；然后將沾有菌體的牙簽或槍頭置于相應(yīng)的裝有PCR混合物的PCR管中洗滌數(shù)下（管子做好記號，如平板上點的是1＃，則管子上也標(biāo)1＃，以便篩選到克隆后的擴到培養(yǎng)），蓋緊管子。

3、將混有菌體的PCR混合物置于PCR儀中，按常規(guī)條件擴增。電泳檢測是否得到目的片斷。如有則為陽性克隆。

4、將已經(jīng)接種有菌落的平板置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，使菌落擴增；次日挑選陽性克隆做進一步篩選或培養(yǎng)。步驟2也可以不點板，直接接種搖菌，如果早上做PCR的話，下午就可以提質(zhì)粒，得到重組載體。

注意事項：設(shè)計引物很關(guān)鍵。一般如果是定向克隆，用載體上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如單酶切或平末端連接），一條引物用載體，一條引物用目的基因上的，這樣就可以比較方便的鑒定了，而且錯誤概率很低。PCR條件的選擇接近，同時挑取的菌體不宜太多，否則會有非特異性擴增。