磷酸鈣-DNA共沉淀法
核酸以磷酸鈣-DNA共沉淀物的形式出現時，可使DNA附在細胞表面，利于細胞吞入攝取，或通過細胞膜脂相收縮時裂開的空隙進入細胞內，進入細胞的DNA僅有1%～5%可以進入細胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細胞DNA整合，在細胞中進行穩定表達，基因轉導的頻率大約為10-4，這項技術能用于任何DNA導入哺乳類動物進行暫時性表達或長期轉化的研究。此方法對于貼壁細胞轉染是zui常用并的方法。
1、配液
(1)2×HBS 1.63g NaCl
1.19g Hepes
0.023g Na2PO4、2H2O
加水至100ml pH7.1過濾，4℃保存
(2)2mmol/L CaCl2 過濾除菌
(3)TE：0.1mmol/L EDTA
1mmol/L Tris-HCL PH8.0
(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL過濾除菌4℃保存。
(5)G418選擇培養基：用含10%胎牛血清的Dmem培養液配制G418，G418濃度為200～ 800mg/L
注意：對受體細胞先做預試驗，選用濃度為在10～14天內能殺死細胞50%以上的zui低濃度。
2、操作步驟[方法一]：
(1)供體DNA制備：方法按前介紹的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。
(2)受體細胞的培養：研究癌基因轉移應選擇不含人類Alu序列的動物細胞系作為受體細胞。如小鼠NIH3T3胚成纖維細胞系等，該細胞有一定自發轉化傾向，一般在轉染前一天接種細胞，接種密度為2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培養，待細胞占50～70%瓶底面積時，用于轉染試驗。
(3)DNA-磷酸鈣沉淀物的制備
①將供體細胞DNA和PSV2-neo質粒載體DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同時向供體細胞DNA液200μl中加入帶基因neo質粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo為1～2mg/L的使用量)。
②取500μl上述DNA溶液加入硅化試管中，緩慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混勻30秒。
③然后立即混旋，室溫下靜置30分鐘，待溶液輕度混濁后，吹打后即用于轉染受體細胞。
(4)轉染受體細胞
①將處于對數生長期已占瓶底50～70%的受體細胞，在轉染前4小時更換一次新鮮培養基，每瓶5ml（25ml培養瓶）。
②吸取0.5mLDNA-磷酸鈣沉淀，加入含5mL培養液的細胞瓶中搖勻。
③置37℃ 5% CO2培養24h或更長，使細胞充分吸入DNA-磷酸鈣結晶顆粒。
④更換新鮮培養基，繼續培養24小時，誘導轉染基因的表達。
⑤更換濃度800mg/L的G418選擇培養液進行篩選。同時設有未能轉染的對照細胞。
⑥培養大約3～5天，對照細胞大部分死亡，這時轉染細胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養基，每3～4天更換一次選擇培養基。
⑦2周后對照細胞死亡，在轉染的細胞瓶中可見有抗藥性的細胞克隆出現，待其增大后再進行克隆化和擴大培養，可建立轉化細胞株，并做進一步鑒定。
本實驗要加入PSV2-neo、DNA與外源DNA共轉染受體細胞，這樣可使受體細胞獲得新霉素(neo)基因的抗藥性，這樣即使癌基因沒有出現明顯的“轉化灶”，也可測出轉入的外源性基因的抗neo的標記。而且還可利用被neo基因導入的受體細胞通過G418選擇培養篩選轉化的細胞建立細胞株。若以獲取“轉化灶”為目的，可不加入PSV2-neo DNA只需將從癌細胞中提取的基因組DNA導入受體細胞即可，其方法如下：
3、基因組DNA轉染[方法二]：
(1)配制磷酸轉染液
NaCl 8.0g
Hepes 5.0g 用時現配，pH很重要一定要控制在6.95±0.65
Na2HPO4 0.099g 消毒滅菌 -20℃貯存備用
加溫水至 1000mL
(2)按前面介紹的方法提取癌細胞基因組DNA。
(3)取供體基因組DNA50～100μg,加3M NaCl或醋酸鈉，使zui終濃度至0.3M混勻。
(4)再加2倍體積無水乙醇3000r/min離心10分鐘，去上清。
(5)加入轉染緩沖液，待DNA充分溶解后，再加入2.5MCaCl2,含zui終濃度為125mM，用吸管輕輕吹打三次(不用攪拌器以防DNA袢結)，置室溫下10～30分鐘，待液體透明度降低，出現微濁蘭色時，即可用于轉染細胞。