1.外源基因在原核細胞中的表達
　　
　　蛋白質通常是研究的zui終目標，因此蛋白質的表達在基因工程中占有非常重要的地位。常用的表達系統有原核細胞和真核細胞。原核細胞表達系統主要使用大腸桿菌，真核細胞表達系統主要有酵母細胞、哺乳動物細胞和昆蟲細胞。這些表達系統各有優缺點，應根據實驗目的和實驗室條件加以選擇。本實驗主要介紹以大腸桿菌為代表的原核細胞表達系統。
　　
　　（1）大腸桿菌表達系統的特點：
　　
　　生物學特性和遺傳背景清楚，易于操作；
　　
　　已開發較多的克隆載體可供選擇；
　　
　　容易獲得大量的外源蛋白（外源蛋白可占細菌總蛋白50％左右）。
　　
　　（2）蛋白質在原核細胞中的表達特點：
　　
　　原核細胞有其固有的RNA聚合酶，識別原核基因的啟動子。因此，在用原核細胞表達目的基因（無論是真核基因還是原核基因）時，一般應使用原核啟動子。
　　
　　原核基因的mRNA含有SD序列，啟動蛋白質的合成。而在真核基因上則缺乏該序列。因此，一些商品化原核表達載體上設計有SD序列，以方便真核基因的表達。
　　
　　原核細胞沒有mRNA轉錄后加工的能力。因此，在原核細胞中表達真核基因時，應使用cDNA為目的基因。
　　
　　原核細胞缺乏真核細胞對蛋白質
　　
　　進行翻譯后加工的能力。如表達產物的功能和蛋白質的糖基化、結構的正確折疊有關，必須慎重使用原核表達系統。
　　
　　外源基因在大腸桿菌中表達時，表達產物往往在胞漿聚集，形成均一密度的包涵體。包涵體的形成有利于保護表達產物不被胞內的蛋白酶降解，而且可以通過包涵體和胞內其他蛋白質密度不同來純化包涵體蛋白。但包涵體蛋白不具有該蛋白的所有生物學活性，往往需要通過變性復性的方法恢復活性，有時只能回復部分活性。
　　
　　（3）蛋白質在原核細胞表達的調控
　　
　　啟動子是轉錄水平調控的主要因素。根據啟動子起始mRNA合成效率的不同，可分為強、弱啟動子，但是啟動子的強弱是相對于不同基因而言的。有些啟動子的活性可以通過物理或化學的方法誘導調控。在基因工程中，原核表達系統通常采用可調控的強啟動子。常用的原核啟動子有：由異丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導的lac啟動子，由3-吲哚乙酸（IAA）誘導的trp啟動子，由溫度誘導的PL和PR啟動子等。噬菌體T7RNA聚合酶啟動子是一個很強的啟動子，近年來在原核表達中得到廣泛應用。
　　
　　SD序列是原核表達中翻譯水平的重要調控因素。SD序列和16SRNA3′端的互補程度、SD序列和目的基因間的距離在很大程度上影響蛋白的合成量。
　　
　　（4）蛋白質在原核細胞中的表達形式
　　
　　外源基因在原核細胞中可以以非融合蛋白、融合蛋白和分泌型表達等不同形式進行表達。具體要根據表達產物使用的目的和操作方法進行選擇。
　　
　　非融合蛋白使用的外源基因必須具有從起始密碼子到終止密碼子的完整讀框。非融合蛋白的一級結構和天然蛋白質相同，是一些體內應用基因工程產品的必要條件。但是非融合蛋白在原核細胞內不穩定，易被降解，而且不易純化。
　　
　　融合蛋白指的是在表達產物的N端或C端具有非目的蛋白的氨基酸殘基。融合蛋白使用的外源基因，必須注意其讀框和載體上原核讀框相符和。融合蛋白在大腸桿菌內較穩定，不易被降解。而且，作為融合蛋白一部分的原核多肽往往是用于純化，或是作為檢測該融合蛋白的“標簽（tag）”。如本實驗中采用金屬螯合親和層析技術純化帶6個His標簽的融合蛋白。
　　
　　分泌型表達指的是在細胞漿內合成的多肽進入內膜和外膜的周間質。進行分泌型表達時，要將一段原核或真核的信號肽序列連接在待表達基因的上游。常用的信號肽有ompT、phoA、pelB等，在表達的蛋白進入細胞周間質時，信號肽被蛋白酶水解，產生游離的表達產物。因此，分泌型表達可以保護外源蛋白不被細胞內的蛋白酶降解，增加表達產物的穩定性，同時，表達蛋白的生物活性較好，易于純化，但是，表達量往往比較低。
　　
　　2.乳糖操縱子的調節機制
　　
　　操縱子是原核細胞基因表達的協調單位。通常由兩個以上功能相關的結構基因以及一些調節序列（如啟動子序列、操縱序列等）組成。乳糖操縱子由三個結構基因Z、Y、A和操縱序列、啟動子、CAP結合位點等調節序列組成（如圖1）。
　　
　　九外源基因在大腸桿菌中的誘導表達和降解物阻遏作用
　　
　　乳糖操縱子的調節包括乳糖（或IPTG）的誘導效應和葡萄糖的降解物阻遏效應。
　　
　　（1）乳糖操縱子的誘導表達
　　
　　當沒有乳糖存在時，調節基因lacI表達，轉錄的mRNA翻譯成阻遏蛋白。阻遏蛋白與操縱序列lacO結合，阻礙了結合在旁邊啟動子的RNA聚合酶向前移動，使目的基因（本實驗中目的基因為綠色熒光蛋白基因）不能轉錄，也就不能翻譯出目的蛋白。也就是說，當沒有乳糖存在時，乳糖操縱子處于阻礙狀態（如圖2）。
　　
　　九外源基因在大腸桿菌中的誘導表達和降解物阻遏作用當有乳糖存在時，乳糖轉化為異乳糖，異乳糖作為誘導物與阻遏蛋白結合，使阻遏蛋白的構象發生改變，而不能結合到操縱序列上，RNA聚合酶可以從啟動子向3′端移動，于是，結構基因可以轉錄出mRNA，然后翻譯出蛋白質。也就是說，當有乳糖存在時，乳糖操縱子被誘導（如圖3）。
　　
　　九外源基因在大腸桿菌中的誘導表達和降解物阻遏作用乳糖操縱子的誘導物是異乳糖。IPTG是異乳糖的結構類似物。由于IPTG不會被分解，它的誘導作用是持久的。
　　
　　（2）乳糖操縱子的降解物阻遏
　　
　　當細菌在含有葡萄糖和乳糖的培養基中生長時，通常優先利用葡萄糖，而不利用乳糖。只有當葡萄糖耗盡后，細菌才能充分利用乳糖，這種現象稱葡萄糖效應，其實質是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又稱降解物阻遏（catabolicrepression）。
　　
　　降解物阻遏的機理：代謝物基因激活蛋白（CatabolitegeneActivationProtein，CAP），又稱cAMP受體蛋白（cAMPReceptorProtein，CRP），屬于一種激活蛋白，對乳糖操縱子進行正調節。CAP分子內同時具有DNA結合區和cAMP結合區。當CAP與cAMP結合后，就可結合到CAP結合位點上，促進轉錄。葡萄糖降解物能抑制腺苷酸環化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，從而降低cAMP的濃度，抑制轉錄。
　　
　　（3）阻遏蛋白負調節與CAP正調節的協調
　　
　　當阻遏蛋白封閉轉錄時，CAP對該系統不能發揮作用；而沒有CAP存在時，即使沒有阻遏蛋白與操縱序列結合，操縱子仍無轉錄活性。只有在CAP存在且沒有阻遏蛋白與操縱序列結合時，或者說只有高乳糖低葡萄糖時，操縱子發揮zui大轉錄活性。這種協調與細菌對碳源的優先利用相一致。
　　
　　本實驗使用的表達載體p32aGFPuv上含有乳糖操縱子的調節序列，目的基因表達的是帶6XHis（組氨酸標簽）的重組綠色熒光蛋白。在IPTG的誘導下，融合蛋白表達可增強105倍，并且可用金屬鰲合親和層析分離純化，zui終獲得純的重組綠色熒光蛋白。
　　
　　【試劑與器材】
　　
　　（一）試劑
　　
　　1.LB液體培養基2L
　　
　　2.10mg/mL氨芐青霉素溶液10mL（全班共用）
　　
　　3.100mmol/LIPTG溶液10mL（全班共用）
　　
　　4.20%葡萄糖溶液10mL（全班共用）
　　
　　5.超聲平衡緩沖液：50mmol/LTris-HCl，500mmol/LNaClpH7.0500mL
　　
　　（二）器材
　　
　　超凈工作臺、恒溫振蕩器、臺式高速離心機、高速冷凍離心機、低溫搖床、高壓破碎儀或超聲破碎儀等。
　　
　　（三）菌株
　　
　　工程菌BL21(DE3)pET-32a和工程菌BL21(DE3)p32aGFPuv。
　　
　　【操作方法】
　　
　　1.分別挑取工程菌BL21(DE3)pET-32a和BL21(DE3)p32aGFPuv的單菌落接種到5mLLB液體培養基（含氨芐，終濃度為100μg/mL，以下同）。
　　
　　2.于37℃、250r/min培養過夜（12h－14h）至對數生長期。
　　
　　3.取三支滅菌試管，各加入5mLLB液體培養基(含氨芐），分別編號為1#，2#，3#，另外取裝于500mL三角瓶中的150mLLB液體培養基（含氨芐），編號6#，全部按1：50的比例接種。1#接種100μLBL21(DE3)pET-32a，2#接種100μLBL21(DE3)p32aGFPuv，3#接種100μLBL21(DE3)p32aGFPuv，6#接種3mLBL21(DE3)p32aGFPuv。
　　
　　4.于37℃、250r/min培養約2h－3h。
　　
　　5.誘導處理：1#、2#不需處理；3#加入20％葡萄糖100μL至終濃度為0.4％，加入5μL100mmol/LIPTG至終濃度為0.1mmol/L；6#加入100mmol/LIPTG約150μL至終濃度為0.1mmol/L。
　　
　　6.于21-25℃、250r/min培養約10h－12h或過夜。
　　
　　7.收菌（注意采集標本并編號）：①從6#三角瓶培養的150mL菌液中取出5mL置于一支試管中（編號為4#）。②分別從1#，2#，3#培養物各取100μL于EP管用于SDS-PAGE。③將1#，2#，3#，4#試管中的菌液分別收集到4個1.5mLEP離心管中，編上相應編號。1#，2#，3#離心棄上清；4#上清收集到另一個EP管，編號為5#。④6#三角瓶中剩余菌液用50mL離心管于5000r/min，4℃，離心10min，棄上清收集菌體。
　　
　　8.于紫外燈下觀察1#-5#管收集的菌體或上清液，觀察哪支管有熒光（熒光強弱），記錄觀察到的現象，并拍照。
　　
　　9.6#收集的全部菌體用50mL超聲平衡緩沖液重懸（50mmol/LTris-HCl，500mmol/LNaClpH7.0)。
　　
　　10.超聲波破菌或高壓破菌，然后用50mL離心管于8000r/min，4℃，離心40min，取上清（棄沉淀）。上清可保存于-20℃冰箱，作下一步親和層析實驗用。
　　
　　超聲操作：冰浴下進行，功率為400W，工作4s，間隙4s，為一次，99次為一周期。共處理六周期。
　　
　　高壓破碎操作：壓力約為150MPa。注意根據裂解液渾濁程度控制流速，1drops/1~4seconds。
　　
　　【注意事項與提示】
　　
　　1.本實驗的目的是比較重組DNA在大腸桿菌中表達時是否受IPTG和葡萄糖存在的影響，所以1#、2#管的細菌在25-28℃培養時不加IPTG和葡萄糖，3#管除加IPTG外還加入葡萄糖，糖的濃度要大于0.2%以上（本實驗采用0.4％）。4#三角瓶細菌僅加IPTG也僅指這次實驗所用的重組DNA菌體而言。有的重組DNA菌體在其表達時除需加IPTG外仍需加入少量的葡萄糖為碳源作誘導。在轉管培養及收菌時要注意各管編號要相應對好，不能混亂。
　　
　　2.不同的重組DNA在不同的宿主菌中蛋白的表達量往往受到IPTG濃度和溫度的影響，采用不同溫度或不同濃度的IPTG來誘導，觀察哪種溫度或哪種濃度條件下其蛋白表達量zui大。在科研中一般都要求這樣做。
　　
　　3.由于本實驗所表達的目的蛋有綠色熒光蛋白，其在大腸桿菌中有很強的熒光。離心后收集的菌體在紫外線的照射下都可見黃綠色熒光，所以把1#、2#、3#、4#沉淀菌體放在紫外燈下觀察其是否有熒光及其熒光的強弱，就可判斷其是否有表達及其所表達的強度。
　　
　　【實驗安排】
　　
　　1.*天晚上9時左右活化種子菌。
　　
　　2.第二天上午配制培養基及滅菌，下午至晚上做放大接菌和誘導。
　　
　　3.第三天上午收菌、觀察、拍照、破碎菌體、離心收集蛋白。
　　
　　【實驗報告要求與思考題】
　　
　　1.對紫外燈下觀察到的結果作出解釋。
　　
　　2.為什么誘導表達的大腸桿菌要在其OD600濃度約為0.5時加入IPTG？
　　
　　3.大腸桿菌的誘導表達常受哪些因素的影響？