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Feulgen反應(Feulgen reaction)是顯示DNA的zui典型的組織化學反應,為學者Feulgen和Rossenbeck于1924年發明,簡稱為Feulgen法。因對DNA的顯示反應具有高度專一性,故常被用來顯示細胞內DNA的分布情況。
1.實 驗 目 的
1.1. 熟悉并掌握Feulgen反應的原理及其實驗操作方法
1.2. 對細胞的免疫組化研究方法有一初步的認識
2.實 驗 原 理
自Feulgen等發明該顯示DNA的Feulgen反應法以來,其作用機制也久經研究和討論,現已取得一致意見。其具體反應原理是,標本經稀鹽酸水解后,DNA分子中的嘌呤堿基被解離,從而在核糖的一端出現了醛基。Schiff試劑中的無色品紅可與醛基反應,形成含有醌基的化合物分子, 因醌基為發色團,故可呈現出紫紅色。也就是說, DNA經稀酸水解后產生的醛基,具有還原作用,可與無色品紅結合形成紫紅色化合物,從而顯示出DNA的分布。其反應機制如下圖所示。
2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3
3.實 驗 用 品
3.1 器材 顯微鏡20臺、立式染色缸80個、水浴鍋1臺。
3.2 材料 香柏油5瓶,擦鏡紙5本,鑷子5把,蓋玻片20片,用carnoy’s固定液固定的肝臟和精巢切片20片。
3.3 試劑
3.3.1. schiff氏試劑 將0.5g堿性品紅置入三角燒瓶內沸騰的蒸餾水中,時時搖動玻璃瓶,煮沸5min使之充分溶解,冷卻至50℃時過濾,加入10ml 1mol/L HCl,冷至25℃時,加入0.5g偏重亞硫酸鈉(Na2S2O3)無水亞硫酸鈉(NaHSO3),在室溫冷暗處至少放置24h(有時需2~3天),使其顏色退至淡黃色,密封瓶口,藏于暗處,保存于4℃冰箱中(可保存數月或更長時間)。在使用前加入0.5g活性碳, 搖1min, 用粗濾紙過濾,濾液應為無色;若液體顏色變為粉紅色,便不能再用。
3.3.2. 亞硫酸水(洗滌劑) 用200ml普通自來水(不要用蒸餾水, 以免引起誤差)、10ml 10%的偏重亞硫酸鈉水溶液和10ml 1mol/L HCl,三者在使用前混合,現用現配。
3.3.3. 1mol/L HCl(水解用) 取82.5ml比重為1.19的鹽酸加蒸餾水1000ml即成(應將鹽酸緩緩加入水中)。
3.3.4. 1%亮綠(light green) 亮綠1g,溶于100ml蒸餾水中。
3.3.5. 30%、50%、70%、85%、95%、100%的梯度酒精及二甲苯。
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