實 驗 目 的

1. 熟悉并掌握Feulgen反應的原理及其實驗操作方法

2. 對細胞的免疫組化研究方法有一初步的認識

實 驗 原 理

自Feulgen等發明該顯示DNA的Feulgen反應法以來，其作用機制也久經研究和討論，現已取得一致意見。其具體反應原理是，標本經稀鹽酸水解后，DNA分子中的嘌呤堿基被解離，從而在核糖的一端出現了醛基。Schiff試劑中的無色品紅可與醛基反應，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基為發色團，故可呈現出紫紅色。也就是說, DNA經稀酸水解后產生的醛基，具有還原作用，可與無色品紅結合形成紫紅色化合物，從而顯示出DNA的分布。其反應機制如下圖所示。

2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3

實 驗 用 品

一、器材 顯微鏡20臺、立式染色缸80個、水浴鍋1臺。

二、材料 香柏油5瓶，擦鏡紙5本，鑷子5把，蓋玻片20片，用carnoy"s固定液固定的肝臟和精巢切片20片。

三、試劑

1. schiff氏試劑 將0.5g堿性品紅置入三角燒瓶內沸騰的蒸餾水中，時時搖動玻璃瓶，煮沸5min使之充分溶解，冷卻至50℃時過濾，加入10ml 1mol/L HCl，冷至25℃時，加入0.5g偏重亞硫酸鈉(Na2S2O3)無水亞硫酸鈉(NaHSO3)，在室溫冷暗處至少放置24h(有時需2~3天)，使其顏色退至淡黃色，密封瓶口，藏于暗處，保存于4℃冰箱中(可保存數月或更長時間)。在使用前加入0.5g活性碳, 搖1min, 用粗濾紙過濾，濾液應為無色;若液體顏色變為粉紅色，便不能再用。

2. 亞硫酸水(洗滌劑) 用200ml普通自來水(不要用蒸餾水, 以免引起誤差)、10ml 10%的偏重亞硫酸鈉水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合，現用現配。

3. 1mol/L HCl(水解用) 取82.5ml比重為1.19的鹽酸加蒸餾水1000ml即成(應將鹽酸緩緩加入水中)。

4. 1%亮綠(light green) 亮綠1g，溶于100ml蒸餾水中。

5. 30%、50%、70%、85%、95%、100%的梯度酒精及二甲苯。

實 驗 方 法

Carnoy液固定

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95%酒精(2次)每次20-30min

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100%酒精2次(30 min, 40 min)

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二甲苯透明

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石臘包埋

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切片貼片

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二甲苯I(20 min)

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二甲苯II(10 min)

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100%酒精5min

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95%酒精5min

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85%酒精5min

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70%酒精5min

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50%酒精5min

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30%酒精5min

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蒸餾水5-10min

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1 mol/L HCl的染色缸內(清洗一下)

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溫浴至60℃的1 mol/L HCl溶液中水解8 min

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取出標本，放入室溫1 mol/L HCl溶液

(注意: 這個步驟非常重要，必須用1 mol/L稀鹽酸沖洗，因為它可以洗去貼在切片上的試劑的痕跡。如用蒸餾水沖洗，則試劑本身也可以水解，所釋放出的堿性品紅，可以使切片內一切嗜堿性物質皆染色從而引起嚴重的錯誤。若切片較厚，可延長其水解時間，而且每次均需更換洗滌劑)

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蒸餾水沖洗3次(使水解停止)

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Schiff試劑中染色40min

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用亞硫酸水洗3~5次(以洗去多余的非特異性色素及擴散的染料)

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流水沖洗5 min

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蒸餾水洗片刻

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1%亮綠復染數秒鐘

(注意: 復染時間切忌過長，以免染色過深，影響對DNA的觀察)

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水洗脫水封片

實 驗 結 果

細胞核中的DNA呈鮮亮的紫紅色反應，它不但反應出DNA存在的部位及其分布情況，而且還可從顏色反應的深淺，來判斷DNA的相對含量。細胞質被亮綠復染成綠色，核仁通常為負反應;但在有些材料的細胞質中，DNA也會出現陽性反應。

作 業

1. 繪圖表示Feulgen反應的染色結果, 并驗交Feulgen反應的*切片1張。

2. 總結Feulgen反應染色結果的影響因素。

思 考 題

1. Feulgen反應的實驗原理是什么?

答：DNA經稀酸水解后產生的醛基，具有還原作用，可與無色品紅結合形成紫紅色化合物，從而顯示出DNA的分布。

2. 在稀鹽酸水解后，為什么要用亞硫酸水進行洗片?

答：亞硫酸可與堿性品紅反應生成品紅亞硫酸，從而可以將用schiff劑染色時所殘留的堿性品紅反應掉，以洗去多余的非特異性色素及擴散的染料。

[ 附 ] Feulgen方法應注意的幾個問題：

1. 對照切片的制做

進行Feulgen反應時, 一般要做一對照切片以便驗證反應結果。對照切片應不經水解直接放在schiff劑內，且應為負反應。但需要注意的是，對照切片在schiff試劑中zui多不要超過1 h (0.5 h即可)，時間過長，試劑本身的酸性也會使DNA水解，從而出現假的正反應。

2. 固定劑的選擇

以前很多人認為，選用的固定劑不應含有醛基或含有氧化劑。后來發現含醛基或氧化劑的固定劑對反應的專一性并沒有影響。實踐證明，一切好的組織學固定劑均適用于Feulgen反應。如Bhampy固定劑、Helly固定劑、Flemming固定劑、OsO4固定劑、Carnoy固定劑、zenker固定劑和Bouin-Aller固定劑。

但在上述固定劑中，以OsO4和Carnoy效果較好，OsO4(1%或0.5%)是Feulgen反應的理想固定劑，只是因OsO4價錢較貴，故一般多采用Carnoy固定液。在Feulgen反應中，不能單獨使用Bouin定液，因為它是Feulgen反應的zui壞固定劑，但經Aller改進后的Bouin-Aller固定液效果卻較好。

3. 水解時間

Feulgen反應通常用稀酸進行水解，但水解的時間一定要適當。如水解時間不夠, 反應就會變弱;如水解時間過長。或水解地過于劇烈，則脫氧核糖也易掉下來，反應也會減弱。適當的水解時間一般為8~12min。但是水解時間長短也要視標本的類型(如厚薄等)、固定劑的性質以及酸的濃度而定。

4. Schiff試劑的作用

Feulgen反應成功與否的一個非常關鍵的因素，就是schiff試劑的質量。有一大類試劑均稱為堿性品紅，它們實際上是由幾種產品分別組成的。因此只能選用注明“DNA染色反應用”的堿性品紅才行。此外，Schiff試劑的配制方法也可影響DNA的染色反應。