當前位置:上海士鋒生物科技有限公司>>公司動態>>人復合培養法
實驗材料:
1. 早產兒或死亡胎兒的皮膚,也可用手術取下的成體皮膚
2. 1000000U/L中性蛋白酶,0.25%胰蛋白酶
3. MEM和HBSS混合液,添加20mmol/L HEPES、200000IU/L青霉素和200mg/L鏈霉素和1.59g/L慶大霉素,HBSS
4. 手術刀、解剖剪、解剖鑷、眼科剪,眼科鑷
5. 不銹鋼網
6. 離心管(15ml、50ml)
實驗方法:
1. 的制備
(1) 取厚1.5mm的皮片,放入4℃用MEM和HBSS混合液浸洗,切成6cm×2cm的皮條。
(2) 在培養皿中加入HBSS,然后放皮條,使面朝下,皮片漂浮其中。在37℃條件下,孵育8-10d,每3d換液1次。
(3) 用眼科鑷將與表皮分離,將切成0.5cm2 小片。將植塊表皮面朝上放入培養皿中。
(4) 在-80℃和37℃下反復凍融植塊10次,以去除存活的細胞成分,從而形成以膠原纖維網架為主的組織,作為以后角質形成細胞生長的支持物,然后將植塊在-80℃下冷凍保存。
2. 復合培養
(1) 在37℃水浴中融化凍存的植塊,放入培養皿內,使乳頭面朝上。加入5ml培養液,在37℃條件下孵育過夜。
(2) 將角質形成細胞種植到植塊上,培養12h。
(3) 角質形成細胞貼附于植塊后,將復合培養的植塊轉移到無菌的不銹鋼網上,移至新的培養皿內。
(4) 加入培養液,培養液的量不能超過不銹鋼網高度,讓表面的角質形成細胞暴露于空氣當中,促進細胞分化。在加液過程中要防止氣泡形成,以免破壞液氣界面。
3. 結果分析
在上復合培養的角質形成細胞分化能力良好,可分化形成明顯的棘細胞層、顆粒細胞層和角質細胞層等表皮結構。
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