摘 要 綜述了近幾年來多肽類物質的提取分離與分析方法，主要包括液相色法、電泳、質譜及核磁共振等方法在肽類物質研究中的應用進展。

多肽類化合物廣泛存在于自然界中，其中對具有一定生物活性的多肽的研究，一直是藥物開發的一個主要方向。生物體內已知的活性多肽主要是從內分泌腺組織器官、分泌細胞和體液中產生或獲得的，生命活動中的細胞分化、神經激素遞質調節、腫瘤病變、免疫調節等均與活性多肽密切相關。隨著現代科技的飛速發展，從天然產物中獲得肽類物質的手段也不斷得到提高。一些新方法、新思路的應用。不斷有新的肽類物質被發現應用于防病治病之中。本文介紹了近幾年肽類物質分離、分析的主要方法研究進展。

1 分離方法

采取何種分離純化方法要由所提取的組織材料、所要提取物質的性質決定。對蛋白 質、多肽提取分離常用的方法包括：鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點沉淀法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法等。這些方法常常組合到一起對特定的物質進行分離純化，同時上述這些方法也是蛋白 、多肽類物質分析中常用的手段，如層析、叫泳等。

1.1 液相色譜 （HPLC）

HPLC的出現為肽類物質的分離提供了有利的方法手段，因為蛋白 質、多肽的HPLC應用與其它化合物相比，在適宜的色譜條件下不僅可以在短時間內完成分離目的，更重要的是HPLC能在制備規模上生產具有生物活性的多肽。因此在尋找多肽類物質分離制備的*條件上，不少學者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何選擇固定相材料、洗脫液種類、如何分析測定都是目前研究的內容。

1．1．1 反相液相色譜（RP-HPLC）

結果與保留值之間的關系：利用RP-HPLC分離多肽首先得確定不同結構的多肽在柱上的保留情況。為了獲得一系列的保留系數，Wilce等利用多線性回歸方法對2106種肽的保留性質與結構進行分析，得出了不同氨基酸組成對保留系數影響的關系，其中極性氨基酸殘基在2～20氨基酸組成的肽中，可減少在柱上的保留時間；在10～60氨基酸組成的肽中，非極性氨基酸較多也可減少在柱上的保留時間，而含5～25個氨基酸的小肽中，非極性氨基酸增加可延長在柱上的保留時間。同時有不少文獻報道了肽鏈長度、氨基酸組成、溫度等條件對保留情況的影響，并利用計算機處理分析得到每種多肽的分離提取的*條件。

肽圖分析（Peptide Mapping）：肽圖分析是根據蛋白 質、多肽的分子量大小以及氨基酸組成特點，使用專一性較強的蛋白 水解酶[一般未肽鏈內切酶（endopeptidase）]作用于特殊的肽鏈位點將多肽裂解成小片斷，通過一定的分離檢測手段形成特征性指紋圖譜，肽圖分析對多肽結構研究合特性鑒別具有重要意義。利用胰蛋白 酶能特意性作用于Arg和Lys羧基端的肽鏈的性質，通過RP-HPLC法采用C18柱檢測了重組人生長激素特征性胰肽圖譜。同時胰島素的肽圖經V8酶專一裂解也制得，并可鑒別僅相差一個氨基酸殘疾的不同種屬來源的胰島素。人類腫瘤壞死因子的單克隆 抗體結構也應用酶解法及在線分析技術確定了肽圖，便于鑒定分析。此項技術已經在新藥開發中得到廣泛應用。

1.1.2 疏水作用色譜（Hydrophobic interaction chromatogrphy，HIC）

HIC是利用多肽中含有疏水基因，可與固定相之間產生疏水作用而達到分離分析的目的，其比RP-GPLC具有較少使多肽變性的特點。利用GIC分離生產激素（GH）產品的結構與活性比EP-GPLC分離的要穩定，活性較穩定。Geng等利用HIC柱的低變性特點，將大腸桿菌表達出的經鹽酸胍乙啶變性得到人重組干擾素-γ。通過HIC柱純化、折疊出高生物活性的產品。不同人尿表皮生長因子（EGF）也利用HIC純化到了，均具有良好的生物活性。HIC可將未經離子交換柱的樣品純化。而RP-HPLC則不能達到這一要求。

1.1.3 分子排阻色譜（Sizs-Exclusion chromatogrphy，SEC）

SEC是利用多肽分子大小、形狀差異來分離純化多肽物質，特別對一些較大的聚集態的分子更為方便，如人重組生長激素（hgH）的分離，不同結構、構型的GH在SEC柱上分離行為*不同，從而可分離不同構型或在氨基酸序列上有微小差異的變異體，利用SEC研究修飾化的PEG的分離方法，此PEC具有半衰期長、作用強的特點。一些分子量較大的肽或蛋白 均可利用此法分離分析。

1．1．4離子交換色譜（Iron-Exchange chromatography,IEXC）

IEXC可在中性條件下，利用多肽的帶電性不同分離純化具有生物活性的多肽。其可分為陽離子柱與陰離子柱兩大類，還有一些新型樹脂，如大孔型樹脂、均孔型樹脂、離子交換纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠樹脂等。在多肽類物質的分離分析研究中，對多肽的性質、洗脫劑、洗脫條件的研究較多，不同的多肽分離條件有所不同，特別是洗脫劑的離子強度、鹽濃度等對純化影響較大。Wu等報道利用離子交換柱層析法，探討分離牛碳酸酐異構體和牛血清白蛋白 、雞血清白蛋白 酶的提取條件，獲得了有價值的數據供今后此類物質分離研究。

1．1．5膜蛋白 色譜（Chromatography of Membrane Protein,CMP）

CMP⁺分離強蔬水性蛋白 、多肽混合物的層析系統，一般有去垢劑（如SDS）溶解膜蛋白 后形成SDS^-融膜蛋白 ，并由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團（P^-端），又具有陽離子鈣（C^-端），與固定相結合主要決定于膜蛋白 的大小、SDS結合量有關。利用原子散射法研究cAMP的分離機制發現，樣品與SDS結合后在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達到分級分離的目的。

1．1．6置換色譜（High-Performance Displacement Chromatography,HPDC）

HPDC是利用小分子置換劑來交換色譜柱上的樣品，從而達到分離的目的。它具有分離組分含量較少成分的特性。利用HPDC鑒定分離了低于總量1%組分的活性人重組生長激素（rHG ）。在研究非毒性交換劑時Jayarama發現硫酸化葡萄糖（Detran Sulfate，DS）是對β乳球蛋白 A和B的良好置換劑，一般DS的相對分子質量為1×10⁴和4×10⁴zui宜。研究表明置換劑的相對分子質量越低，越易于與固定相結合，因此在分離相對分子質量小的多肽時，需要更小的置換劑才能將其置換純化出來。