CCK-8 Frequently Asked Questions:

1. CCK-8與其他細(xì)胞增殖-毒性檢測方法的優(yōu)勢在哪里？

2. 單孔接種多少個細(xì)胞？

當(dāng)使用96孔板時，貼壁細(xì)胞的小接種量至少為1000個/孔（100μL培養(yǎng)基）。檢測白細(xì)胞的靈敏度相對較低，因此建議接種量不低于2500個/孔（100μL培養(yǎng)基），建議先做幾個孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量。若使用24孔板或6孔板，請先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，然后按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8。

3. 如何設(shè)定空白對照？

在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8，測定450nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)）時，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可以在不含細(xì)胞、加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，測定450nm的吸光度作為空白對照。

4. 哪些物質(zhì)會影響CCK-8的測定？

當(dāng)有還原性物質(zhì)存在時會增加CCK-8的測定，增加OD值；當(dāng)有氧化性物質(zhì)存在時會抑制測定反應(yīng)的發(fā)生，降低OD值。在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可。

5. 做加藥實(shí)驗(yàn)時，藥物對測定是否有影響？如何解決？

有時會有影響。如果藥物具有還原性就會和CCK-8發(fā)生顯色反應(yīng)，增加OD值。解決方法：首先要確認(rèn)藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，測定450nm的吸光度。如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基（只加CCK-8）的吸光度高，則說明藥物有影響，可在加CCK-8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。

6.   CCK-8對細(xì)胞的毒性大小如何？

CCK-8對細(xì)胞毒性相當(dāng)?shù)停瑯拥募?xì)胞在CCK-8檢測后還可用于其他細(xì)胞增殖的檢測實(shí)驗(yàn)，比如結(jié)晶紫檢測法，中性紅檢測法或DNA熒光檢測法等。由于每種細(xì)胞對CCK-8的耐受力不同，因此若需要長時間孵育，先檢測下細(xì)胞在加入CCK-8后的活力。

7. 如果沒有450nm的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片？

還可使用430-490nm之間的濾光片，但450nm濾光片的檢測靈敏度膏。

8. CCK-8能否對活細(xì)胞進(jìn)行染色？

不能。因?yàn)镃CK-8的主要成分是一種水溶性四唑鹽（WST-8），并通過電子載體1-methoxy PM將活細(xì)胞中的電子交換到培養(yǎng)基中的WST-8上，因WST-8及其生成的甲臢染料是高度水溶性的，不會進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，所以CCK-8不能對活細(xì)胞進(jìn)行染色。

9.  須設(shè)定參比波長？設(shè)定參比波長的目的是什么？

不一定，CCK-8在參比波長處沒有吸光度。設(shè)定參比波長的目的是為了去除由于樣品渾濁產(chǎn)生的吸收。

10. 每次測定的數(shù)值不一樣，是什么原因？如何解決？

可能存在以下幾個原因：a）當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，培養(yǎng)板外一圈的孔容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。通常情況外一圈孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用；b）有可能因?yàn)镃CK-8沾在壁上而產(chǎn)生誤差，建議在加入CCK-8，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻；c）每孔的細(xì)胞數(shù)量過多或過少。請預(yù)先在1000~100,000個/孔范圍內(nèi)摸索條件。

11. 如果OD值太低，可以采取什么辦法？

可采取2種辦法：a）適當(dāng)增加細(xì)胞數(shù)量；b）延長加入CCK-8后的孵育時間。

12. 如果OD值太高，但不能減少細(xì)胞數(shù)量，如何解決？

可以縮短加入CCK-8后的孵育時間。比如，可以把加入CCK-8后的孵育時間由原來的3h縮短到2h。

13. CCK-8顯色過程種如何終止反應(yīng)？

有以下幾種方法（96孔板）：a）顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板置于4℃冰箱；b）每孔加10 μL0.1M的HCL溶液；c）每孔加10 μL 1% w/v SDS溶液。反應(yīng)終止后請?jiān)?4h內(nèi)測定OD值。

14. 必須預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞嗎？

不一定。如果需要保持細(xì)胞的加狀態(tài)，建議預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞。如果不做預(yù)培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可能會不穩(wěn)定。有的科研人員不做預(yù)培養(yǎng)，但做標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測時需要統(tǒng)一檢測條件。

15. 預(yù)培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基需要細(xì)胞計(jì)數(shù)嗎？

一般情況下用胰蛋白酶處理對數(shù)增長期的細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，制備成一定濃度的細(xì)胞懸液即可。如果想要精密計(jì)數(shù)細(xì)胞的話，可以預(yù)培養(yǎng)后取培養(yǎng)基用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

16. CCK-8對于不同的細(xì)胞靈敏度是否一樣？

不一樣。懸浮細(xì)胞相比較難染色。對于貼壁細(xì)胞，一般加入CCK-8后1-4h吸光度已經(jīng)很高，但對于懸浮細(xì)胞則可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的染色時間或增加細(xì)胞數(shù)量來解決。

17. 懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞在數(shù)量上有何區(qū)別？

懸浮細(xì)胞由于染色比較困難，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時間。貼壁細(xì)胞染色比較容易，若細(xì)胞數(shù)量過大，有時吸光度會超過酶標(biāo)儀的讀數(shù)。 

18. 應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？

建議每次都做。雖然細(xì)胞相同，但是細(xì)胞狀態(tài)不一樣。對于狀態(tài)不一樣的細(xì)胞建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能有輕微的差異，此時也建議分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

19. 實(shí)驗(yàn)之前是否需要先檢測以下培養(yǎng)基和CCK-8之間是否有反應(yīng)？

建議使用一個孔做下檢測，因有時培養(yǎng)基種可能含氧化還原物質(zhì)。正式實(shí)驗(yàn)之前有必要先確認(rèn)下培養(yǎng)基和CCK-8是否有反應(yīng)。一般正常的OD值應(yīng)該在0.4以下。

20. 有時在藥物作用下，細(xì)胞已經(jīng)死亡，但脫氫酶的活性還在，是否能計(jì)算細(xì)胞數(shù)量？

不能。由于CCK-8是通過和細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶進(jìn)行反應(yīng)間接反應(yīng)活細(xì)胞數(shù)量。如果細(xì)胞已經(jīng)死亡，即使脫氫酶的活性還有，測定出來的細(xì)胞數(shù)量將會比真實(shí)值高，不能反應(yīng)真實(shí)的活細(xì)胞數(shù)量，建議采用別的方法測定。

21. 可否使用384孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)？

可以。向每孔加入培養(yǎng)基總體積10%的CCK-8。如果加入CCK-8體積太少，可以先將CCK-8稀釋一倍，然后加入培養(yǎng)基總體積20%的量。

22. CCK-8與胸苷結(jié)合檢測之間是否有相關(guān)性？

有。但請注意由于CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同，因此，結(jié)果可能不同。

23. CCK-8能否檢測細(xì)菌細(xì)胞？

可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細(xì)胞。向每孔100μL大腸桿菌培養(yǎng)液中加入10μL CCK-8，培養(yǎng)1-4h或過夜。

24. 如果加入藥物中含有金屬，是否有影響？

金屬對CCK-8顯色有影響。當(dāng)終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅分別會抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使得靈敏度降低。如果終濃度是10mM，將會100%抑制。

25. CCK-8的穩(wěn)定性如何？

CCK-8在2-8℃能穩(wěn)定保存1年，推薦用此方法檢測；長期不用也可置于-20℃穩(wěn)定保存2年。

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