1、取得*無(wú)血液殘留的肺臟：

實(shí)驗(yàn)前將大鼠全身血液放凈，取得*無(wú)血液殘留的肺臟。

2、消化肺組織：

常用于細(xì)胞消化的酶有胰蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶。胰蛋白酶是zui早用于消化、分離上皮細(xì)胞的酶，現(xiàn)在一般用損傷性小的彈性蛋白酶來(lái)替代胰蛋白酶。但這種酶卻有活性不穩(wěn)定，有效作用時(shí)間短暫，容易自我降解等問(wèn)題。Dobbs L G等認(rèn)為彈性蛋白酶能更有選擇性的消化分離上皮細(xì)胞[9]。胰蛋白酶消化沒(méi)有選擇性，會(huì)帶來(lái)像內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等一些不能在后面的分離步驟中去除的雜質(zhì)細(xì)胞，因此彈性蛋白酶更有助于提高上皮細(xì)胞的純度和產(chǎn)量。與此相反，Cunningham A C等發(fā)現(xiàn)，與彈性蛋白酶相比，用胰蛋白酶可以獲得更大產(chǎn)量的Ⅱ型上皮細(xì)胞[10]。膠原酶可以用來(lái)輔助消化細(xì)胞間質(zhì)。用幾種酶混合的方法比單一酶消化效果更好，但目前還沒(méi)有文獻(xiàn)定量描述*化的酶消化方法。Finkelstein J N等發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)支氣管把酶灌注到完整的肺中消化，或把肺組織剪碎放入消化液中消化。前者比后者更有效。作者在自己的實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了通過(guò)支氣管把酶灌注到完整的肺中消化效果更好。

3、分離純化細(xì)胞：

上皮細(xì)胞的分離純化技術(shù)經(jīng)過(guò)二三十年的發(fā)展日漸成熟，呈現(xiàn)多樣化的特點(diǎn)。目前對(duì)細(xì)胞的分離純化主要有以下幾種方法：

(1)密度梯度離心：

密度梯度離心分離細(xì)胞的原理是不同細(xì)胞的沉降系數(shù)不同，在密度梯度離心中細(xì)胞所處的位置也相應(yīng)不同。這是zui早用于分離Ⅱ型上皮細(xì)胞的方法，至今仍在使用。用ficoll或percoll不連續(xù)梯度離心，豬肺泡Ⅱ型細(xì)胞zui終純度可以達(dá)到70%-85%左右[11-12]。沉降系數(shù)與細(xì)胞的直徑和天然密度有關(guān)。由于Ⅱ型細(xì)胞與其他細(xì)胞存在密度和大小的交叉(如巨噬細(xì)胞)，僅僅通過(guò)離心并不能有效去除雜細(xì)胞。Kikkawa(1974)讓巨噬細(xì)胞吞噬一些重顆粒(如硫酸鋇)，改變其密度，可以幫助區(qū)分巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞。離心后的純度達(dá)到94%,但產(chǎn)量明顯減少[8]。上皮細(xì)胞的大小和密度變化范圍較大，用密度梯度離心要丟掉和其他細(xì)胞重疊的細(xì)胞層，這必然會(huì)造成某些密度大的Ⅱ型細(xì)胞損失，產(chǎn)量大大降低。

(2)濾膜分離：

濾膜分離的原理是根據(jù)細(xì)胞的大小不同來(lái)進(jìn)行分離。Ⅱ型上皮細(xì)胞約10μm，比巨噬細(xì)胞(約25μm)和Ⅰ型細(xì)胞(50μm-100μm)小，用150μm孔徑的濾膜初濾除去大的組織碎片，30 μm ～40 μm孔徑的濾膜除去全部Ⅱ型細(xì)胞和部分巨噬細(xì)胞[13]，采用15μm的濾膜精濾。用濾膜分離操作簡(jiǎn)單，它和其他分離方法聯(lián)合使用可以提高純度。

(3)流式細(xì)胞技術(shù)：

流式細(xì)胞技術(shù)分離的原理是根據(jù)不同細(xì)胞之間的熒光差異。根據(jù)不同種細(xì)胞的特征識(shí)別，用熒光物質(zhì)標(biāo)記篩選。上皮細(xì)胞內(nèi)含有豐富的脂類(lèi)物質(zhì)，用親脂性熒光素標(biāo)記，可以得到純度很高的細(xì)胞。Funkhouser J D等用抗Ⅱ型上皮細(xì)胞的單抗進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，再用流式細(xì)胞儀進(jìn)行篩選，得到96%的Ⅱ型上皮細(xì)胞[14]。但熒光素對(duì)被標(biāo)記細(xì)胞有害。Rochat T R等發(fā)現(xiàn)自然熒光和直角光散射可以區(qū)分巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，這給不經(jīng)熒光標(biāo)記分離上皮細(xì)胞提供了可能[15]。流式技術(shù)分離細(xì)胞的產(chǎn)量很低，但純度*。這種技術(shù)經(jīng)過(guò)完善在將來(lái)會(huì)更有吸引力。

(4)免疫黏附：

免疫黏附的原理是各種細(xì)胞的膜表面有不同的免疫活性物質(zhì)。巨噬細(xì)胞和其他大多數(shù)非Ⅱ型細(xì)胞表面都有IgG上的Fc片段的受體。Uhal(1989)用IgG包被塑料板，把細(xì)胞懸液置于板上，巨噬細(xì)胞和其他大多數(shù)非Ⅱ型細(xì)胞因?yàn)楹蠪c片段的受體而與IgG結(jié)合，吸附到板上，不黏附的Ⅱ型細(xì)胞被沖洗下來(lái)[16]。經(jīng)過(guò)多年的摸索，這種方法近幾年已開(kāi)始應(yīng)用，簡(jiǎn)便易行，可除去絕大多數(shù)的巨噬細(xì)胞，有效的提高上皮細(xì)胞的純度。

(5)貼壁選擇：

貼壁選擇的原理是各種細(xì)胞完成貼壁的時(shí)間不同，這種特性用在培養(yǎng)時(shí)做篩選。根據(jù)zui終目的，綜合其中幾種方法能達(dá)到較好的效果。例如先用濾膜過(guò)濾，再用IgG包被法。